摘要
NAC转录因子是植物特有的、家族成员较多的一类转录因子，其表达受植物发育时期和多种环境因素的诱导，并在植物发育、激素反应以及抗逆性的调控中起重要作用。本实验以铁皮石斛愈伤组织诱导的类原球茎为实验材料，优化超声波处理辅助农杆菌介导铁皮石斛遗传转化体系，使用常规PCR法分离克隆NAC转录因子，再采用染色体步移法获得NAC转录因子5’和3’侧翼序列，通过生物信息学手段对启动子和基因结构进行预测，并构建该启动子的表达载体，从而为进一步研究NAC启动子遗传转化和调控机制提供思路和手段，主要研究结果如下： (1)以铁皮石斛愈伤组织诱导的类原球茎为材料，通过PLBs对潮霉素敏感性实验确定潮霉素选择压，结果发现，PLBs对潮霉素较为敏感，10mg/L潮霉素能够有效抑制PLBs的增殖和分化并完全死亡，因此确定10mg/L为潮霉素有效选择压浓度。 (2)优化SAAT法转化条件，研究超声波预处理时间、根瘤农杆菌侵染时间和共培养时间对GUS瞬时表达率的影响，实验结果表明，使用40KHZ、90W的超声波对预培养2d的PLBs超声处理3min，再用预培养2hr的OD600为0.8～0.95的农杆菌侵染液侵染30min，转入共培养基暗培养5d，所获得的蓝色斑点数为42个/100mg PLBs，而且其除菌也相对容易，其中预培养基、侵染液和共培养基中均含有100μM AS。 (3)采用常规PCR法和染色体步移法分离克隆出一条长度为6324bp的基因序列，通过分析发现，NAC转录因子在起始密码子和终止密码子之间长度为1611bp，含有3个外显子和2个内含子，在距离终止密码子下游859处和886处分别有一个ployA结构和Stem-loop结构，在TTS上游348处和378处分别为TSS位点和TATA box。5’侧翼序列长度为TSS前3401bp，PlantCare分析表明，该序列不仅含有TATA box、CAAT box等启动子核心顺式作用元件，而且含有光信号反应元件、激发子响应元件、生理节律元件、激素诱导相关的顺式作用元件、生长发育相关顺式元件和逆境胁迫响应元件，这些顺式元件的存在与NAC转录因子主要生物学功能相符合。 (4)通过软件预测，确定翻译起始位点上游862bp大小的序列为NAC启动子核心区域，分离克隆该段基因，并构建表达载体，采用冻融法转入到农杆菌中，经双酶切验证证明构建和转化成功。
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