摘要
山羊痘是一种急热性传染病，由山羊痘病毒(goatpoxvirus，GTPV)引发，临床上以出现发热和全身起痘为典型特征，具有很高的发病率和死亡率。我国目前使用山羊痘弱毒疫苗AV41株来预防山羊痘，但其在我国部分省份尤其是南方部分地区的羊痘防疫过程中，发现存在有安全隐患，可产生诸多不良反应，如全身发痘、孕羊流产等。因此，有必要进一步研制更为安全有效的新型基因工程疫苗。 本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等方面的技术和手段，以GTPV弱毒疫苗毒株AV41为模板，分别设计4对引物，PCR扩增ORF5～ORF19和ORF149～ORF15两个区域两侧共四个基因组片段，分别作为同源重组左侧臂和右侧臂；运用分子技术，分别将两侧重组臂相连，并在两个重组臂中间插入报告基因EGFP和筛选基因gpt的表达盒，构建转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg;分别将转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg与GTPVAV41株共转染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，使其在细胞内发生同源重组，加压筛选并纯化重组GTPV;最后鉴定重组GTPV和检测其生物学特性。 通过一系列实验研究，确定了GTPV基因组中的两个病毒复制非必需区，分别成功构建了敲除掉GTPV毒力相关基因ORF5～ORF19之间共15个ORF和ORF149～ORF151之间共3个ORF的两株重组山羊痘弱毒株。同时证实这两个基因重组缺失毒株均可稳定遗传，并保持了亲本毒株在细胞培养物中的生长特性。这为研制更安全、高效的山羊痘基因工程弱毒疫苗奠定基础，并为开发羊痘活载体疫苗提供了理想的载体。
NETL