摘要
手足口病是儿童常见病，多种肠道病毒均可引起手足口病，其中科萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)为我国近几年手足口病的主要病原体。CA16感染导致的HFMD症状相对较轻，病程多为自限性，但也有研究显示其与心肌炎、心包炎及其它严重疾病相关，并有少量CA16感染致死的报道，因此有必要增强对CA16的了解及防控技术研究。目前尚未有成熟的CA16快速诊断试剂和预防疫苗，因此开发相关诊断试剂与疫苗对于手足口病的防治具有重要意义。本研究目的是建立CA16病毒的分离鉴定技术平台，获得较为完整的CA16病毒库；分析CA16分离株与不同国家、地区和不同时期CA16分离株的进化关系；建立优化的新型CA16中和抗体检测方法，并将其应用于CA16单克隆抗体的筛选、CA16和EV71交叉中和反应的研究；建立CA16病毒规模化培养、浓缩及纯化的技术路线，初步评价CA16病毒的免疫原性。本研究结果将为CA16防控研究和疫苗研制提供重要的基础和工具。 本研究建立了CA16病毒分离鉴定技术平台，通过对厦门地区120份手足口病标本的分离鉴定，获得41株CA16病毒株，其基因型别主要为CA16 B1a和B1b基因亚型，初步建立了CA16病毒库。本研究进一步对CA16 VP1序列的系统进化树分析，比较20株CA16分离株与GenBank中不同CA16代表株的进化关系。同时，也分析5株厦门地区CA16分离毒株的全长序列与来自世界不同国家地区和不同时期代表毒株的进化关系，并对其5'UTR和3'UTR保守区段的同源性进行分析。研究结果可为厦门地区CA16病毒代表株的选择提供基础。 另一方面，本研究建立了一系列CA16鉴定的方法，包括CA16滴度检测方法，免疫荧光方法，CA16中和抗体检测方法，可以实现对CA16病毒的快速特异性鉴定，并检测其病毒滴度和中和抗体效价。与此同时，本研究也对本实验室的新型CA16中和抗体快速高通量检测方法的进行了优化，主要从细胞类型、细胞密度、边缘效应及中和效价的判定方式4个方面着手，以求提高该检测方法的适用范围，增加其与传统检测方法的关联度。并将优化后的方法应用于CA16单抗的筛选和中和抗体的检测。目前，本研究已通过应用该方法从238株针对CA16的单克隆抗体中筛选获得30株具有较高中和效价的单抗。此外，本研究将该方法应用于CA16和EV71抗血清和单抗的交叉中和能力的研究，结果显示，单独感染的CA16和EV71抗血清不存在明显的交叉中和，目前筛选获得的中和单抗尚不能够可同时交叉中和CA16与EV71。 本研究进一步对CA16病毒的规模化培养、浓缩和纯化工艺进行了摸索，初步建立了CA16病毒的规模化生产，浓缩和纯化的工艺路线。目前已获得了10140mL滴度为106875TCID50的病毒液，经初步浓缩纯化获得完整的CA16病毒颗粒，为CA16检测试剂盒和候选疫苗研发提供了重要原料。本研究也比较了CA16的不同灭活方法的灭活效果，同时对BPL、HCHO和HEAT三种灭活方式灭活的免疫原性变化做了考察，初步评价了CA16病毒的免疫原性。上述研究结果为后期的CA16预防疫苗研发工作提供重要的基础和参考。
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