摘要
以青蒿素为基础的联合药物疗法(ACTs)被认为是目前治疗恶性疟疾的最有效方法。然而青蒿素供应不足且价格昂贵,限制了ACTs的广泛使用。本研究旨在采用基因工程手段构建异源类异戊二烯生物合成途径,利用大肠杆菌发酵高效合成抗疟药青蒿素前体--紫穗槐-4,11-二烯。首先在Escherichia coli DHGT7中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因,利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸(FPP),成功获得了紫穗槐-4,11-二烯。为提高前体供给,引入粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的甲羟戊酸(MVA)途径,紫穗槐-4,11-二烯产量提高了13.3倍,达到151 mg/L。进一步研究发现了3个限速酶,分别是紫穗槐-4,11-二烯合酶、HMG-COA还原酶和甲羟戊酸激酶；通过调节这些酶的水平,紫穗槐-4,11-二烯产量提高了7.2倍,摇瓶培养达到235 mg/L,为高效生物合成抗疟药青蒿素前体--紫穗槐-4,11-二烯奠定了基础。 另外,本研究建立了薄层色谱法(TLC)快速半定量检测甲羟戊酸含量,并建立了气相色谱与质谱联用法(GC-MS)定量检测甲羟戊酸和紫穗槐-4,11-二烯含量,为代谢产物含量测定和代谢途径调控提供了技术支持。
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