摘要
[目的] 产头孢菌素β-内酰胺酶(AmpC)是肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的重要机制之一。AmpC酶几乎能水解除四代头孢和碳氢霉烯类以外的所有β-内酰胺类药物,尤其是头孢菌素类药物。AmpC酶起源于染色体,而质粒介导的AmpC酶可以在菌株之间相互传递,因此备受关注。为了了解产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在深圳地区的分布现状,本研究应用多聚酶链反应(PCR)及DNA测序技术对近年来临床菌株中对头孢西丁耐药的菌株的AmpC酶基因进行分析,探讨产AmpC酶基因对其耐药表型的影响;同时也对产AmpC酶菌的超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)基因进行检测,以期了解菌株同时产两类酶的状况及其耐药表型的改变,为临床抗感染治疗及流行病学研究提供信息和依据。 [方法] 1.菌株来源:收集深圳市人民医院2005年1月1日至2007年12月31日住院及门诊患者分离的大肠埃希菌597株,肺炎克雷伯菌206株;深圳市北大医院2007年7月1日至2007年12月31日住院及门诊患者分离的大肠埃希菌15株,肺炎克雷伯10菌株;深圳市第二人民医院2007年7月1日至2007年12月31日住院及门诊患者分离的肺炎克雷伯菌25株。 2.表型筛选:通过头孢西丁耐药初筛试验(纸片扩散法),其抑菌圈直径≤18mm,为可疑产AmpC酶菌株。 3.质粒提取:对产AmpC可疑阳性菌株用碱裂解法提取质粒。 4.质粒AmpC酶基因的扩增:采用含6对引物的多重PCR方法扩增菌株的质粒DNA,并扩增产物片断长度进行初步分型。 5.AmpC酶全长编码基因扩增:根据阳性菌株基因型的DNA序列重新设计引物,扩增AmpC酶基因的完整编码区。 6.AmpC酶基因DNA测序:对PCR扩增产物进行双向测序,进行拼接,DNA序列与Genbank数据库进行检索比对,确定其基因型。 7.产ESBLs酶分析:对AmpC酶阳性菌株进行ESBLs确证试验。 8.ESBLs酶的初步分型:分别用TEM、SHV、CTX-M型基因引物对ESBLs阳性菌株进行PCR扩增。 9.药敏分析:应用K-B法分析耐药基因赋予细菌的耐药特性。 [结果] 1.AmpC表型初筛结果:通过头孢西丁耐药初筛试验,从853株菌株中筛选出头孢西丁耐药大肠埃希菌109株,肺炎克雷伯菌72株,合计181株。 2.AmpC酶阳性率:多重PCR扩增显示181株菌中60株AmpC酶基因阳性,总阳性率为33.1%;其中109株大肠杆菌中有13株AmpC基因阳性,阳性率为11.9%(13/109);72株耐头孢西丁肺炎克雷伯菌中有47株阳性,阳性率为65.3%(47/75)。 3.AmpC基因群分析:13株AmpC酶基因阳性的大肠埃希菌中,1株为CIT型,12株为DHA型,47株.AmpC酶基因阳性的肺炎克雷伯菌中,2株为CIT型,46株为DHA型,其中在1株菌株中同时存在CIT和DHA两种基因。 4.AmpC基因DNA序列分析:针对CIT和DHA基因序列重新设计引物,PCR扩增全长编码基因序列并进行DNA测序,结果显示所有CIT型阳性株均为CMY-2型,DHA阳性株均为DHA-1型。 5.AmpC酶阳性株ESBLs检测结果:60株AmpC酶基因阳性株中有43株ESBLs阳性。其中13株AmpC酶阳性大肠埃希菌中8株检测出ESBLs检出率为61.5%,47株AmpC酶阳性肺炎克雷伯菌中35株检测出ESBLs,检出率为74.5%。 6.ESBLs基因分析结果:43株ESBLs阳性菌中共有32株(74.4%)携带CTX-M基因,20株(46.5%)携带SHV基因,17株(39.5%)携带TEM基因。 7.产AmpC酶肺炎克雷伯菌对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松和头孢他啶等6种抗生素的耐药率远高于不产AmpC酶株;产酶株对头孢克洛、头孢塞肟和复方新诺明的耐药率稍高于非产酶株。 8.产AmpC酶大肠埃希菌对头孢他啶的耐药率则远高于非产酶株,对氯霉素和阿莫西林/克拉维酸的耐药率则高于非产酶株。但产酶株对环丙沙星的耐药率远却低于不产AmpC酶大肠埃希菌。 9.单产AmpC酶肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率高于同时产AmpC酶和ESBLs株;单产AmpC酶株对庆大霉素、头孢克洛和哌拉西林的耐药率低于同时产AmpC酶和ESBLs株。 [结论] 1.深圳地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中AmpC酶基因为DHA-1和CMY-2,其中DHA-1为本地区流行的主要基因型。 2.AmpC阳性菌株中ESBLs检出率很高,分别检出TEM、SHV和CTX-M型基因,同一菌株携带多种β-内酰胺酶基因较常见。 3.药敏感试验结果显示,产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对多种抗生素的耐药性高于AmpC酶阴性菌株; 4.合并产AmpC酶和ESBLs肺炎克雷伯菌比单产AmpC酶菌株对亚胺培南和美罗培南的耐药率低。
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