摘要
本课题为国家863项目“饲料用抗菌肽的分子改良和产品研制”的子课题。 目前，抗生素的广泛和大量应用导致药物残留和病原菌耐药性等问题变得日益严重。抗菌肽因其独特的抗菌机制，使细菌不易对其产生耐药性，加之其突出的广谱抗菌、抗病毒及肿瘤细胞等生物学活性，在替代传统抗生素方面显示了巨大潜力和广阔的应用前景。 人源乳铁蛋白肽hLF18-40是人乳铁蛋白N端第18到40位氨基酸组成的一段多肽，由23个氨基酸组成，对大肠杆菌和白色念珠菌都有抗菌活性。本课题旨在hLF18-40基础上研究具有抗菌活性的最小长度的乳铁蛋白肽，同时利用基因工程技术实现hLF18-40在大肠杆菌中的高效表达，为建立基因工程菌规模化生产hLF18-40及其它抗菌肽的工艺奠定理论与实践基础。 本课题根据抗菌肽hLF18-40的氨基酸序列，依照大肠杆菌密码子偏爱性，采用SOE技术，设计合成了hLF18-40的编码基因；采用融合表达策略，构建了pET-43.1a-hLF18-40、pET-41b-hLF18-40和pET-32a-hLF18-40三个表达质粒，表达结果显示pET-43.1a-hLF18-40获得了较高的可溶融合蛋白表达；将融合蛋白Nus-hLF18-40进行Ni2+柱亲和层析，平均每升细菌培养物获得约50mg融合蛋白，经进一步的除盐和浓缩后，用肠激酶切割释放抗菌肽hLF18-40。这为今后基因工程法表达人乳铁蛋白肽提供了经验。 同时，将hLF18-40的C末端氨基酸逐一缩短直至hLF18-32，用化学法合成hLF18-40、hLF18-39、hLF18-38、hLF18-37、hLF18-36、hLF18-35、hLF18-34、hLF18-33和hLF18-32九条人乳铁蛋白肽，采用改进肉汤微量稀释法分别测定以上九条肽对E.coli25922的MIC，结果发现hLF18-40的MIC为40μM，去掉hLF18-40 C端的Arg后其抑菌活性有所提高(20<MIC<40)，但提高不大。hLF18-38、hLF18-37、hLF18-36的抑菌活性逐渐减小，但hLF18-35的活性突然上升，其MIC与hLF18-40相同。
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