摘要
转录因子是实现基因表达调控的关键组分,几乎参与植物生长发育的每个方面。转录因子在分子水平上主要通过两个方面行使其功能:首先,通过DNA结合结构域与基因启动子上特定的原件结合;其次,通过转录激活/抑制结构域招募其他协同因子或者复合体,启动/抑制基因的表达。为了深入研究转录因子在植物生长发育中的关键作用,我们以拟南芥为研究对象,将拟南芥的1,589个转录因子与GAL4AD融合,构建了拟南芥转录因子功能研究平台。使用该平台对已报道的NPRI-TGA蛋白相互作用和CHE-CCA1蛋白-DNA相互作用进行了成功验证,证明了拟南芥转录因子平台的可用性。为了提高文库的使用效率,我们还发展了一套基于酵母接合的筛选方法并进行了验证。 中介因子在真核生物中功能保守,主要作为RNA聚合酶Ⅱ和特异转录因子之间的桥梁调控基因表达。拟南芥中介因子Med25参与了phyB介导的开花时间的控制,最近有人证明Med25是荣莉酸(JA)依赖的抗病反应的关键因子,控制了JA应答的多个标志基因(如PDF1.2)的表达,但是对Med25调控基因表达的机制还不清楚。为了解决这一问题,我们以Med25为诱饵(bait),利用转录因子平台进行酵母双杂交筛选;结果共得到8个与Med25相互作用的转录因子,其中大部分属于AP2/EREBP家族。同时,我们以PDF1.2启动子上的GCC-box为bait,利用转录因子平台进行酵母单杂交筛选,结果得到6个转录因子且全部属于AP2/EREBP家族。值得注意的足,我们发现有三个AP2/EREBP转录因子(即AT4G18450、AT3G23220和AT3G23240)既可以与Med25相互作用,也可以结合PDF1.2启动子上的GCC-box,并通过体外EMSA和GST-Pull down实验证实了这些相互作用。这表明Med25可能通过结合这三个转录因子,直接调控JA下游标志基因PDF1.2的表达。 植物激素是植物内源的信号分子,参与植物的器官形成、形态建成、对环境的应答、对病虫害的抵御等等生理过程。虽然植物对赤霉素(GA)和JA信号具有不同的应答反应,但是它们的信号转导途径具有很多相似之处,尤其是信号传递需要分别将关键的抑制因子DELLA和JAZ通过泛素介导的蛋白降解途径降解。JAZ通过抑制转录因子功能达到抑制JA信号的作用,但是其目前鉴定的靶标还不能完全解释JA的生理功能,暗示还有其它转录因子参与。根据两个信号途径框架的相似性,我们推测DELLA也是通过与转录因子直接相互作用抑制信号传递的。因此我们利用转录因子平台,以DELLA和JAZs做为bait进行筛选,得到一批与它们相互作用的分属多个家族的转录因子,暗示着DELLA和JAZ可能通过与不同类别的转录因子相互作用来实现激素信号的多效性。BiFC实验证明W68在植物体内与DELLA蛋白相互作用。利用截短蛋白的酵母双杂交实验证明,DELLA是通过两个寡聚化位点(LZ1和IZ2)结合在W68的DNA结合结构域上。我们通过嵌合抑制子技术构建了W68显性缺失突变体,该突变体植株表现出多种发育缺陷表型,如植株矮化、花序紧凑、主根不能伸长、花器官变小以及叶片早衰等,暗示W68可能作为DELLA的靶标参与植物的多个生长发育过程调控。此外,我们还鉴定出DELLA与油菜素内酯(BR)途径的关键正调控因子BRZ1相互作用,暗示GA和油菜素信号转导途径存在crosstalk。 综上所述,本论文提供了一个研究拟南芥转录因子功能的平台及大规模筛选分子互作的方法,并利用该平台对几个植物激素的信号途径进行了探索,证明该系统是研究拟南芥转录调控网络很有效的工具。
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