摘要
目的： 针刺是临床治疗哮喘的一种有效方法，但其抗哮喘效应的物质基础和分子机制尚不明确。蛋白质组学在揭示生物过程的分子物质基础和寻找新的生物标记物等方面具有突出优势。本研究利用差异蛋白质组学技术筛选并鉴定针刺抗哮喘效应特异性差异表达蛋白。对针刺调节的差异蛋白进行生物信息学分析，探讨针刺抗哮喘的可能调控机制和生物信息传导途径。在此基础上，对针刺效应相关蛋白进行初步的体外功能验证研究，以期为哮喘提供新的治疗靶标。 方法： 采用OVA致敏和激发制作大鼠哮喘模型，针刺大椎、风门、肺俞对哮喘大鼠进行治疗，通过呼吸功能检测、肺泡灌洗液白细胞计数以及肺组织病理学观察评价针刺抗哮喘效应。应用双向电泳技术分析大鼠肺组织蛋白质表达谱的改变，挑选针刺抗哮喘效应蛋白并进行质谱鉴定，Western blot验证部分蛋白表达的变化。生物信息学技术对针刺抗哮喘效应蛋白进行功能分类和蛋白-蛋白相互作用分析，构建针刺抗哮喘效应可能的生物信息传导途径。构建针刺抗哮喘效应蛋白S100A8重组质粒并进行蛋白表达纯化，原代培养大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)，在ASMC水平对S100A8蛋白进行功能验证研究。 结果： 1.针刺治疗哮喘大鼠呼吸阻力在OVA激发后第2～3min显著下降(P＜0.05)，BALF中白细胞总数、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞计数较模型组均明显降低，肺部炎症细胞浸润较哮喘模型大鼠明显减轻。 2.针刺哮喘大鼠肺组织蛋白质组差异分析显示针刺抗哮喘效应相关调控蛋白32个，其中30个蛋白点经过LC-ESI-MS/MS被鉴定为28种蛋白。 3.Western blot蛋白表达验证CC10、S100A8、RhoGDI2、RAGE、sRAGE的表达改变与蛋白质组分析结果一致。 4.生物信息学分析显示针刺抗哮喘效应相关调控蛋白主要参与免疫／炎症调节生物学过程，针刺能够降低促炎症蛋白（S100A8、RAGE）的水平和提高抗炎症蛋白（CC10、sRAGE）的水平。 5.抗哮喘效应相关调控蛋白功能之间的相互作用形成潜在的针刺免疫调节和抗炎症反应生物信息传导途径，其中CC10、S100A8、RAGE、sRAGE、RhoGDI2等均为关键节点蛋白。 6.成功构建大鼠S100A8原核表达质粒，获得S100A8重组蛋白；组织贴壁法分离大鼠ASMC成功，获得原代培养的ASMC。 7.S100A8重组蛋白干预ASMC12h，24h和48h后均能促进ASMC的增殖，其中24h后的增殖效应最明显；1μg剂量S100A8重组蛋白增殖效应明显优于其他剂量。 结论： 1.针刺能够降低哮喘大鼠呼吸阻力，改善呼吸功能，并显著降低哮喘大鼠BALF中白细胞总数和嗜酸粒细胞计数，抑制肺部以嗜酸粒细胞浸润为主要表现的炎症病理反应，具有明显的抗哮喘作用。 2.针刺抗哮喘效应与上调抗炎症反应蛋白的表达和下调促炎症反应蛋白的表达有关，抗哮喘效应蛋白主要参与免疫炎症生物学过程。 3.针刺可能通过提高CC10水平、抑制S100蛋白/RAGE信号以及调控Rho/Rho激酶信号转导通路，发挥免疫调节和抗炎症反应的生物学效应。 4.重组针刺抗哮喘效应特异性调节蛋白S100A8在体外通过RAGE介导的信号传导以剂量依赖和时间依赖方式诱导气道平滑肌细胞增殖。 5.蛋白质组学技术能够揭示针灸治疗疾病这一复杂生命现象的内在分子基础，有利于促进针灸作用机理研究。
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