摘要
近年来随着人们对防御素生物活性研究的深入，其在机体免疫系统中发挥的功能逐渐显露，用防御素作为一种新型抗菌剂以提高动物抗感染能力的研究已成为新的热点。 本实验应用基因合成方法合成鸭β-防御素(AvBD)2基因肽段，将它克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZα-A中，构建非融合表达质粒。利用酵母本身的α-factor信号肽进行分泌表达。重组质粒pPICZ-α-A-AvBD2通过限制性内切酶SacI线性化后，经电穿孔法转入毕赤酵母野生型菌株X-33中，使之与毕赤酵母染色体进行同源重组。经ZeocinTM抗性筛选，得到高拷贝转化子。经抽提重组毕赤酵母转化子基因组DNA，然后进行PCR鉴定。挑选PCR鉴定为阳性的重组酵母转化子进行甲醇诱导表达，获得了分泌表达的重组鸭β-防御素-2多肽。 Tricine-SDS-PAGE电泳表明表达产物分子量大小约为4.32kD左右，与预期大小相符。体外活性检测表明表达产物具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌能力。对表达产物进行超高效液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定(UPLC-ESI-MS/MS)，鉴定出的氨基酸序列与目的基因相吻合，进一步证明了目的蛋白确实成功得到表达。 以两周龄的雏鸡为对象，初步研究了重组抗菌肽AvBD2防治雏鸡细菌感染的效果。通过预试验，确定了选用的致病性大肠杆菌和致病性沙门氏菌对雏鸡的最小致死剂量(MLD100)和抗菌肽体内保护剂量的参考值。在治疗实验中，在致死剂量的大肠杆菌和沙门氏菌肌肉注射后，分别注射250μg和300μg抗菌肽AvBD2有一定的治疗效果，一周后雏鸡存活率分别为90%和80%。表明，抗菌肽AvBD2有较好的体内防治效果。 综上所述，本研究成功地应用基因工程和蛋白质工程技术表达了鸭抗菌肽AvBD2，表达出来的蛋白在体内外均表现出良好的抗菌活性，为抗菌肽AvBD2的工业化生产和在畜牧养殖业中的应用奠定了基础。
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