摘要
磷酸二酯酶(PDE)一系列的同工酶作为第二信使3’，5’-环磷酸腺苷(cAMP)和3’，5’-环磷酸鸟苷(cGMP)唯一的水解代谢酶，在生物体内对控制环磷酸核苷的浓度，细胞内外信息传导，调节生命活动等起着举足轻重的作用。以磷酸二酯酶作为药物靶点，寻找新型抑制剂的研究也已经广泛开展起来，而对于PDE催化水解的机理探索正是这些研究的基础。目前发现的哺乳动物体内有11类磷酸二酯酶，他们的活性区域都有十分相似的氨基酸序列和空间结构，因此其催化水解机理也应该是相似的。相关的文献报道以磷酸二酯酶的X射线晶体结构为基础，提出磷酸二酯酶的催化水解是以二价双金属离子为中心，由氢氧根离子作为水解反应的亲核试剂，环磷酸核苷O3’原子附近的组氨酸作为质子供体，完成催化水解反应。然而酶的活性区域的结构在催化反应前后应该是不同的，用晶体结构代替PDE结合底物时的结构来分析催化水解的机理得到的结果并不合理。 本文用选取3种磷酸二酯酶结构PDE4d2(PDB ID：1PTW)、PDE5a(PDB ID：1T9S)和PDE10a(PDB ID：20UQ)，采用分子对接、分子动力学模拟的方法，得到磷酸二酯酶与环磷酸核苷结合的活性区域结构，并经过统计分析建立量化计算模型，找到了新的PDE催化水解的机理：1)环磷酸核苷(底物)进入PDE的活性区域，与双金属结构作用；2)结合在金属离子上的HO-进攻环磷酸基团上的P原子引发水解反应，同时聚集在O3’原子附近的水分子提供一个质子给O3’原子，帮助O3’-P键断裂；3)水解反应结束，产物离开活性区域，提供质子的水分子变成新的HO-，并结合金属离子等待下一个底物进入进行下一个催化循环。通过分析残基与底物的距离以及水分子的空间分布函数，作者认为并不是靠近底物的组氨酸提供质子给环磷酸核苷促进O3’-P键断裂，而是水分子直接提供质子。磷酸二酯酶作为cAMP和cGMP的催化水解酶，使底物以一定构象结合在水解区域，而组成活性区域的残基为水解反应提供了合适的环境促使环磷酸核苷发生选择性水解反应。相关的计算结果已经于2011年10月28被Journal of Theoretical and Computational Chemistry收录。 PDE抑制剂一直以来都是药物研发的重要领域。哒嗪酮类化合物不仅可以作为磷酸二酯酶抑制剂，还具有其它广泛的药用价值，例如抗癌活性，消炎作用等等。将糖基引入具有药用价值的化合物是新药筛选、改良已有药物药性常用手段。本文研究了在实验室合成卤代苯基哒嗪酮糖苷过程中曾经遇到产物难以控制的问题，解释了糖苷化的反应机理，找到了得到不同糖苷产物的原因，为实验室合成类似糖苷提供了理论指导。 实验室合成糖苷使用两种方法，Koenigs-Knorr反应和相转移催化法都遵循SN2反应过程。得到的两种产物，卤代苯基哒嗪酮氧苷和氮苷分别为动力学产物与热力学产物，且两种产物可以相互转化。在Koenigs-Knorr反应中，银离子对于得到氧苷产物有重要的作用。相关计算结果发表在Computational and theoretical Chemistry，963(2011)119-124。 5-氟尿嘧啶及其衍生物是广泛应用于临床的抗肿瘤药物，将其与糖基结合生成糖苷可能降低其副作用，提高药效。本文研究了实验室采用相转移催化法和Koenigs-Knorr反应合成2-苯氧基-5-氟尿嘧啶和2-苯硫基-5-氟尿嘧啶氮苷、氧苷的反应机理。计算结果表明两种方法的糖苷化反应均为SN2反应过程。使用相转移催化法，两种5-氟尿嘧啶衍生物生成氮苷需要克服的能垒明显低于氧苷，这一点与实验中主要得到氮苷产物相吻合。银离子在使用Koenigs-Knorr反应制备氧苷产物的过程中起到结合溴离子，引发取代反应以及络合N原子确定氧苷形成的作用。 本文的主要创新点有：1.根据不同PDE的结构，利用分子对接和分子动力学模拟的方法建立量化计算模型来讨论催化水解机理，而不是直接采用PDE的X射线晶体结构分析水解机理。2.提出了新的磷酸二酯酶的催化水解机理，并综合考虑水分子作为溶剂在水解反应中的作用。3.在实验的基础上讨论了哒嗪酮衍生物和5-氟尿嘧啶衍生物的糖苷化机理，为类似化合物的糖苷化实验提供理论指导。
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