超低分子量肝素对神经细胞凋亡及细胞内钙调控的实验研究

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中文摘要：研究背景：随着世界老龄人口的日益增多，阿尔茨海默病等中枢神经系统退行性疾病的防治显得日益重要。但阿尔茨海默病发病机制复杂，病因至今尚不明确。目前提出的有淀粉样蛋白级联、tau蛋白异常磷酸化、胆碱能神经凋亡、自由基损伤、兴奋性毒性等学说。而自1984年Khachaturian提出钙平衡失调学说后，不断得到证实和发展，已逐渐为人们所认同。细胞内Ca2+超载是急性和慢性神经退行性病变致细胞凋亡或死亡的“最后共同通路”。其中，IP3受体介导的细胞内钙释放可启动线粒体途径或激活Ca2+敏感酶等，引起细胞凋亡。因而，调节IP3受体介导的Ca2+释放有可能成为阿尔茨海默病的治疗靶点。肝素(UFH)是IP3受体的竞争性拮抗剂，但由于分子量大不能穿过细胞膜，只能通过显微注射进入细胞内，所以其应用受到极大限制。超低分子量肝素(ULMWH)是经UFH降解而成的寡糖片段，平均分子量2.2kDa，具有分子量小、分布区间集中、生物利用度高、抗凝活性低等优点，因而阐明ULMWH对神经细胞的作用及其分子机制，具有重要的理论意义和实用价值，将为AD的防治提供新型有效的措施。研究目的：本研究观察ULMWH对Aβ25-35诱导的神经细胞凋亡的作用及对诱导物刺激细胞内Ca2+升高的影响，以期阐明ULMWH的作用机制，为临床应用提供理论依据。实验方法： 1.Aβ25-35诱导细胞损伤及其纤维形成的鉴定 (1)光学显微镜下观察原代培养大鼠神经细胞的形态，采用MTT法检测不同浓度的Aβ25-35(10、25、35、50μM)作用24h对神经细胞活力的影响，确定Aβ25-35诱导细胞损伤的最佳浓度。 (2)最佳损伤浓度的Aβ25-35在37β孵育7天后，用透射电镜或荧光指示剂硫磺素T考察Aβ25-35的纤维形成。 2.ULMWH对Aβ25-35诱导神经细胞凋亡的影响取培养好的神经细胞，加入2、10、50μg/ml的ULMWH预孵育2h，然后加入最佳浓度的Aβ25-35继续孵育24h，对以下指标进行测定。 (1)采用MTT法检测细胞活力，LDH测定试剂盒测定细胞LDH漏出率，考察ULMWH对Aβ25-35所致细胞损伤的影响。 (2)Annexin V/PI-FITC双染色法定量测定细胞凋亡百分率；Hoechst33258荧光染色法观察ULMWH对凋亡细胞形态的影响；TNNEL法检测凋亡细胞形态及计算凋亡指数，评价ULMWH对Aβ25-35诱导细胞凋亡的所用。 (3)以Western blotting法检测神经细胞内Bcl-2和Capase-3蛋白表达变化；以荧光指示剂Fura-2/AM测定细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化，初步探讨ULMWH抑制Aβ25-35诱导神经细胞凋亡的分子机制。 3.ULMWH对神经细胞内钙浓度的影响 (1)取培养7d的神经细胞，加入浓度分别为1、10、100μg/ml的ULMWH，以Fura-2/AM测定细胞内钙离子浓度的变化，分别考察在有钙和无钙条件下ULMWH对静息神经细胞[Ca2+]i的影响。 (2)取培养7d的神经细胞，加入浓度分别为1、10、100μg/ml的ULMWH预孵育5min，然后加入终浓度为20mM的KCl或500μM的谷氨酸以刺激外钙内流，Fura-2/AM测定细胞内钙离子浓度的变化，考察ULMWH对KCl或谷氨酸诱导神经细胞外钙内流的影响。 (3)取培养7d的神经细胞，首先加入10μg/ml的皂角苷处理细胞，提高细胞膜对加入IP3的通透性。分别加入浓度为1、10、100μg/ml的ULMWH预孵育5min，然后加入终浓度为10μM的IP3刺激细胞内钙释放，Fura-2/AM测定细胞内钙离子浓度的变化，考察ULMWH对IP3诱导神经细胞内钙释放的影响。 (4)分离神经细胞线粒体和内质网，加入浓度分别为1、10、100μg/ml的ULMWH预孵育5min，再加入终浓度为10μM的IP3刺激内质网或线粒体内钙释放，考察ULMWH对IP3诱导神经细胞线粒体或内质网Ca2+释放的影响。实验结果： 1.Aβ25-35诱导细胞损伤及其纤维形成的鉴定 (1)神经细胞培养至7d时胞体增大，突起进一步增多并逐渐成网，细胞间出现互相迁移靠拢，部分神经元聚集成团，可见密集的神经元细胞网络，未见明显的胶质细胞，可用于实验。 (2)细胞存活率随Aβ25-35浓度升高而降低，但由于50μM Aβ25-35处理组与对照组相比细胞存活率仅为43.17％，光镜下多数细胞已变圆。而35μMAβ25-35处理组与对照组相比细胞存活率为60.66％，结合光镜下细胞形态，选用35μM作为Aβ25-35诱导神经细胞损伤的作用浓度。 (3)透射电镜观察：对照组中35μM Aβ25-35孵育30 min后，主要以无定形结构存在，呈絮状，未见纤维结构形成。老化处理组中35μM Aβ25-35孵育7d后，以淀粉样纤维结构为主，纤维相互交织呈网状结构，纵横交错，呈针状或晶状聚集，无分枝。 (4)Th-T荧光分析：老化组荧光强度平均值为82.79，与对照组(10.88)相比有显著性差异(P<0.01)，间接反映Aβ25-35纤维化的程度。 2.ULMWH对Aβ25-35诱导神经细胞凋亡的影响 (1)以35μM Aβ25-35处理后，细胞活力显著降低(P<0.01)，LDH漏出率显著升高(P<0.01)，与2、10、50μg/ml ULMWH共同孵育，能够升高神经细胞的存活力，降低LDH漏出率，结果具有显著性差异(P<0.01)，确定ULMWH对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有保护作用。 (2)流式细胞术检测结果显示，Aβ25-35处理后细胞凋亡率显著增加(P<0.01)，而不同浓度的ULMWH处理后，细胞凋亡率呈现浓度依赖性降低；Hoechst33258荧光染色结果发现，Aβ25-35可以促使神经细胞凋亡，荧光显微镜下细胞核内可见浓染致密的颗粒状荧光，呈现出凋亡细胞典型的核固缩、核碎裂，而ULMWH能够改善细胞凋亡形态，减少凋亡细胞的数量；TUNEL实验发现，对照组的细胞核呈现均一的蓝染，无明显的凋亡细胞，Aβ25-35处理组细胞核呈棕褐色，核固缩，呈现出明显的TUNEL阳性改变，ULMWH处理组细胞核棕褐色染色的细胞明显减少。证明ULMWH对Aβ25-35诱导的神经细胞凋亡具有抑制作用。 (3)Aβ25-35处理神经细胞24h，Caspase-3蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达降低，而ULMWH能够显著降低Caspase-3表达，升高Bcl-2表达，结果具有显著性差异。 (4)与对照组相比，Aβ25-35能显著提高细胞内游离钙水平，而不同浓度的ULMWH能够显著抑制细胞内钙浓度的升高，结果具有显著性差异(P<0.01)。 3.ULMWH对神经细胞内钙浓度的影响 (1)1、10、100μg/ml的ULMWH能使含钙和不含钙条件下的静息神经细胞内[Ca2+]i有所降低，结果具有显著性差异(P<0.01)。 (2)20mM KCl或500μM谷氨酸可使细胞内钙离子浓度明显升高(P<0.01)，而预孵不同浓度的ULMWH对KCl引起的[Ca2+]i升高并无明显抑制作用，但对谷氨酸引起的[Ca2+]i升高有一定的抑制作用。 (3)IP3能显著提高细胞内钙离子浓度(P<0.01)，预孵不同浓度的ULMWH能够显著抑制IP3引起的[Ca2+]i升高，具有显著性差异(P<0.01) (4)IP3能使线粒体和内质网释放到外液中的Ca2+浓度升高(P<0.01)，以不同浓度的ULMWH预孵5min后，再应用IP3刺激，能显著抑制IP3诱导的内钙释放，具有显著性差异(P<0.01)。结论： (1)ULMWH可显著提高细胞生存率，抑制细胞内LDH释放，对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有保护作用。 (2)ULMWH能通过升高Bcl-2表达，降低Caspase-3表达，抑制细胞内钙离子浓度升高，从而改善细胞形态，降低细胞凋亡率，抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡作用。 (3)ULMWH对KCl诱导的钙内流无明显影响，对谷氨酸诱导的[Ca2+]i升高有部分抑制作用。 (4)ULMWH能够在亚细胞水平上显著降低IP3诱导的[Ca2+]i升高。

作者：

郝丽娜

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关键词：

超低分子量肝素阿尔茨海默病淀粉样蛋白钙元素调控 IP3受体

授予学位：

博士

学科专业：

药理学

导师：

张庆柱

学位年度：

2011

学位授予单位：

山东大学

语种：

中文

中图分类号：

R74