摘要
动脉粥样硬化是一种多器官受累的常见血管疾病,高血压、冠心病为其重要并发症,成为日益威胁人类生命的主要死亡原因之一,其危害性已举世公认。它是许多心血管疾病的病理基础,主要累及大型及中型肌弹力型动脉,以主动脉、冠状动脉及脑动脉为多见,常导致管腔闭塞或管壁破裂出血等严重后果,动脉硬化早期受累血管常伴有血管收缩性增强,并导致血管痉挛。动脉壁具有三层结构:内膜、中膜、外膜。每一层均具有独特的组织学、生物学及功能特征,并且每层以独特的方式来维持血管稳定及调节血管对各种刺激及损伤的反应。近二十年来,有关血管内膜对血管功能的影响进行了深入广泛地研究,血管内膜在调节血管平滑肌功能中的作用已得到普遍的认同。但是,越来越多的证据显示外膜调节血管功能的作用远大于其作为血管壁支撑结构的作用。近年来有关血管外膜在调节血管平滑肌舒缩功能中的作用方面的研究日益受到关注。1994年,Shimokawa等用IL-1β包裹猪冠状动脉外膜介导冠脉病变的动物模型,证明在体情况下,血管外膜慢性炎症刺激能导致血管收缩反应性增高,提示血管外膜能调节血管平滑肌的收缩功能,参与血管张力的调节;用硅胶管包裹兔颈动脉的动物模型已成为研究动脉粥样硬化的经典动物模型。此动物模型以硅胶管包裹血管导致血管外膜慢性损伤但不直接损伤血管中膜及内膜,产生具有人动脉粥样硬化早期特征的新生内膜病损;除新生内膜形成外,硅胶管包裹还能引起与早期人类动脉粥样硬化病变相似的血管功能的变化:对5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的收缩血管活性高敏感。 C.型利尿利钠肽(C-type natfiuretic peptide,CNP)作为钠尿肽家族的新成员,其生理作用十分广泛,但是目前关于CNP的临床研究报道甚少,由于A-型利尿利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和B-型利尿利钠肽(brain nalriuretic peptide,BNP)的临床意义极受重视而且研究广泛,故近年CNP在疾病中的应用研究逐渐增多,尤其发现CNP与血管损伤性疾病关系密切。在心血管系统中CNP主要与B型利尿钠肽受体(NPR-B)结合,激活颗粒型鸟苷酸环化酶(particulate guanylylcyclase,pGC)生成环磷鸟苷酸(Cyclic Guanosine Monophosphate,cGMP),环磷鸟苷酸依赖的蛋白激酶(cGMP-Dependent Protein Kinase G,PKG)I是cGMP的主要细胞内受体,在cGMP介导的多种生理过程中发挥着核心作用,如调节血管平滑肌的收缩和舒张,抗高血压,抗心肌肥大,抗动脉粥样硬化和抗血管损伤/再狭窄等。 既往实验虽然已经证实硅胶管包裹大鼠颈动脉导致血管中膜持续性收缩及对5-HT收缩血管反应敏感性增加,但是机理不是十分清楚。 目的： 基于以上研究及理论基础,本实验复制了利用硅胶管包裹大鼠颈动脉制备血管外膜慢性损伤刺激导致血管收缩性增强的动物模型,观察血管外膜慢性损伤对血管收缩功能的影响以及血清及局部组织中CNP和其下游靶点cGMP、PKG I的表达和变化;并且应用不同剂量的通心络和经典的调脂药物阿托伐他汀进行干预,观察传统中医络病理论指导下研制的复方制剂通心络超微粉剂慢性治疗对该动物模型的影响,探讨通心络和他汀类药物降低血管收缩反应性的机制:是否与增加了血清和血管组织中的CNP有关。 方法： 一、动物模型部分 用硅胶管包裹大鼠颈动脉制备血管外膜慢性损伤介导血管收缩性增高的动物模型:12周的雄性SD大鼠,体重220-250克。普通大鼠食料喂养1周后分成5组,每组12只,除空白对照组外,其它组腹腔内注射10%水合氯醛0.3ml/100g麻醉大鼠,用内径1.5mm,长10mm的硅胶管纵向切开后包裹于右侧颈动脉外,缝合伤口。实验共分为5组:①正常组:普通饮食2周。②手术对照组(即模型组):普通饮食喂养1周,硅胶管包裹右侧颈动脉1周,继续普通饮食。③药物干预组:本组包括一个阿托伐他汀组和两个通心络超微粉组:普通饮食+阿托伐他汀钙片(5mg/kg/day)喂养1周,硅胶管包裹右侧颈动脉1周,继续给予普通饮食+阿托伐他汀钙片(5mg/kg/day)喂养;普通饮食+两个不同剂量的通心络超微粉(300mg/kg/day,600mg/kg/day)喂养1周,硅胶管包裹右侧颈动脉1周,继续给予普通饮食+不同剂量的通心络。于包管术后1周,用超声外周血管血流量测定仪测量大鼠双侧颈动脉血流量,并观察血管对局部应用5-HT的反应;并且取双侧颈动脉标本,HE染色,光镜下观察血管外膜慢性损伤对血管形态学的影响;运用elisa的方法测定各组血清中的CNP含量、血管组织中cGMP含量:运用蛋白印记的方法测定血管组织中CNP、PKGⅠα、PKGⅠβ的表达。 二、细胞培养部分 体外大鼠主动脉平滑肌细胞,利用酶联免疫吸附法(ELISA)的方法测定在不同的浓度(10-5M～10-9M)、在不同时间点(0,5,10,15,20,30分钟)下CNP刺激平滑肌细胞生成的cGMP的含量,选取合适的CNP浓度和时间点进行下一步实验;利用Westen-blot的方法测定在不同时间点(0,5,10,15,20,30分钟)下,CNP刺激平滑肌细胞生成的PKGⅠα和PKGⅠβ的情况:利用共聚焦显微镜技术体外观察5-HI、对于主动脉平滑肌细胞的收缩反应,并且观察CNP在体外是否对5-羟色胺的收缩反应有拮抗作用及其可能的机制。 结果： 一、动物模型部分 各组大鼠右颈动脉经HE染色后普通光镜下进行观察比较发现,手术对照组出现明显的病理改变:血管包裹1周后血管口径明显变小,内弹力板极度弯曲,中膜明显增厚,外膜轻度增生,少量的炎细胞浸润:同手术对照组相比,各个药物干预组应用2周均能明显改善外膜慢性炎症损伤部位的颈动脉形态学改变。 硅胶管包裹一周后,手术对照组右侧颈动脉基础血流量(2.60±0.21ml/min)较正常组右颈动脉明显降低(3.49±0.11ml/min,p＜0.01),并且手术对照组右颈动脉对血管局部应用5-HT的收缩反应性明显增强,局部滴注5-HT后血流量变化率(38.22±3.10%)明显高于正常组右颈动脉(16.35±0.76%,p＜0.01);与正常组相比,各个药物干预组的右颈动脉基础血流量及局部滴注5-HT后血流量变化率无明显差异(p＞0.05);但同手术对照组相比,各个药物干预组对右颈动脉血流量及局部滴注5-HT后血流量变化率差异明显(p＜0.01),同时发现低剂量通心络组的血流变化率同阿托伐他汀组相似(p=0.625),而高剂量通心络组的血流变化率同阿托伐他汀相比有所减少,有统计学差异(p=0.016)。 硅胶管包裹大鼠右颈动脉一周后,运用elisa的方法测定各组血清中的CNP含量,结果发现:虽然手术对照组大鼠血清中CNP的含量较正常组有所降低,同时各个药物干预组同手术对照组相比,血清中CNP的含量均有增高趋势,但是组间比较无统计学差异(p=0.089)。 硅胶管包裹大鼠右颈动脉一周后,运用elisa的方法测定各组血管组织中的cGMP含量,结果发现:对照组右颈动脉同正常组相比,血管组织中的cGMP表达下降且有显著的统计学差异(p＜0.01);而通心络各个剂量组和阿托伐他汀组右颈动脉血管组织中的cGMP含量同对照组右颈动脉相比明显增高有统计学差异,同时发现两个通心络组右颈动脉血管组织中cGMP含量同阿托伐他汀组相比仍有增高且有极显著的统计学差异(p=0.000) 硅胶管包裹大鼠右颈动脉一周后,运用Westen-blot方法测定各组右颈动脉组织中CNP的表达,结果发现:正常组血管组织中有CNP表达,手术对照组右颈动脉血管组织中的CNP表达较正常组减少约30%,且有统计学差异(p=0.016),而各个药物干预组右颈动脉血管组织中的CNP均有增高趋势,且有统计学差异(0＜0.05),同时发现右颈动脉血管组织中CNP的表达,低剂量通心络组同阿托伐他汀组相比无统计学差异(p=0.225),而高剂量通心络组同阿托伐他汀组相比有统计学差异(p=0.010)。 硅胶管包裹大鼠右颈动脉一周后,运用Westen-blot方法测定各组右颈动脉组织中PKG I的表达,结果发现:1、正常组血管组织中有PKGⅠα的表达,手术对照组右颈动脉血管组织中的PKGⅠα表达较正常组减少有统计学差异(p＜0.05),而各个药物干预组血管组织中的PKGⅠα表达较手术对照组均明显增高,有统计学差异(p＜0.05)。同时发现血管组织中PKG Iα的表达,低剂量通心络组同阿托伐他汀组相比无统计学差异(p=0.310),而高剂量通心络组同阿托伐他汀组相比有极显著的统计学差异(p=0.000);2、运用Westen-blot方法测定血管组织中PKGⅠβ的表达,结果发现:各组血管组织中均有PKGⅠβ的表达,虽然对照组PKGⅠβ的表达较其它组有下降趋势,但组间比较无统计学差异(p＞0.05)。 二、细胞培养部分 运用酶联免疫吸附法(ELISA)的方法,我们发现:在不同浓度(10-5M～10-9M)时,CNP刺激大鼠主动脉平滑肌细胞生成cGMP量均在10分钟左右出现一个高峰,故细胞培养部分均采用中间浓度(10-7M的CNP)和10分钟这个时间点。 运用Westen-blot方法测定给予10-7M的CNP刺激后,大鼠主动脉平滑肌细胞在不同时间点(0,5,10,15,20,30分钟)生成的PKG I情况,结果发现:1、正常的大鼠主动脉平滑肌细胞中有少量的PKGⅠα的表达,加入CNP后各个时间点PKGⅠα的表达均明显增加,有统计学差异(p＜0.05);2、同时我们也发现,在正常的大鼠动脉平滑肌细胞中也有少量的PKGⅠβ的表达,但是在加入CNP后在各个时间点上PKGⅠβ的表达没有明显变化,无统计学差异(p＞0.05)。 运用共聚焦显微镜技术,我们发现:①10-5M的5-HT后,细胞表面积(PCSA)明显减小(大约减少34.04%±9.14%),有统计学差异(P＜0.05),表明5-HT在体外仍然有强烈的收缩平滑肌细胞的作用:②而在加入CNP(10-7M)之后再加入同样浓度的5-HT,细胞表面积缩小程度明显减轻,与加入5-HT之前相比没有统计学差异(p＞0.05),表明CNP在体外有拮抗5-HT的收缩平滑肌细胞的作用;⑨最后在加入CNP和PKG I的阻断剂KT-5823(2宰10-6M)后再加入同样浓度的5-HT,细胞表面积又再次明显缩小(大约减少33.24%±10.62%),CNP的抗5-HT的收缩作用被KT-5823所逆转,表明CNP抵抗5-HT的收缩作用主要与PKGⅠα有关。 结论： 1、血管外膜慢性损伤早期阶段可以引起血管慢性痉挛,血流量下降,血管对5-HT的反应敏感性增加,局部血管组织中CNP的蛋白表达下调是血管外膜慢性损伤引起血管收缩反应性增强的重要机制之一;并且CNP的降低血管收缩反应性的作用同局部血管组织中PKGⅠα的表达密切相关,同局部血管组织中PKGⅠβ的表达关系不密切。 2、应用通心络超微粉和阿托伐他汀一样均能预防和改善血管外膜慢性损伤所致的血管慢性痉挛及血管对5-HT的高反应性,这种作用主要通过上调局部血管组织中CNP的蛋白表达来发挥其缓解血管痉挛的作用,并且PKGⅠα在CNP的降低血管收缩反应性、舒张血管的作用中发挥了关键的作用,而CNP下游的另一个靶点PKGⅠβ与CNP的这种作用关系不密切。
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