摘要
细胞内物质转运是一个庞大而复杂的转运系统，囊泡是这一系统中高度动态和可调控的重要运输载体。囊泡转运过程在细胞的增殖和发育过程中具有十分重要的生物学意义，是生命活动的基本事件之一。以往对于囊泡特征和转运的研究，往往是在固定细胞中获得的静态数据，很难在活体状态下对单个囊泡进行追踪和观测分析。一个主要的技术障碍是无法以较高的空间和时间分辨率获得囊泡转运和融合过程中的动力学参数，因而无法揭示每个步骤具体的分子调控机制。因此，急需引入崭新的标记和成像技术对囊泡的快速转运进行实时活体观测及相关动力学特征的研究。本文引入单分子研究技术和隐失波荧光成像技术，利用FM4-64标记白杆花粉管内的分泌囊泡，通过活体状态下对分泌囊泡进行实时动态地追踪，分析花粉管中分泌囊泡转运的动力学参数，以及微丝、微管骨架和高尔基体与囊泡转运之间的动态关系。在隐失波显微镜(evanescent wave microscope，EWM)下，FM4-64标记的分泌囊泡在白杆花粉管顶端集中分布，其分布模式与被子植物花粉管中的“V”字型不同。与激光共聚焦显微镜下观测到的分泌囊泡集群的分布模式不同，在高时空分辨率的隐失波显微镜下，可以清晰的观测到花粉管顶端区和亚顶端区呈现点状分布的分泌囊泡。 本研究实现了植物细胞中对单个囊泡的可视化观测，获得了花粉管内分泌囊泡的动态连续的图像，并进行动力学特征的分析。结果发现：花粉管内囊泡呈现长距离和短距离两种运动，短距离运动囊泡的平均速度为1.09±0.02μm/s，最高速度为3.5μm/s，而长距离运动囊泡的平均速度为1.93±0.05μm/s，最高速度可达5.85μm/s。此外，对分泌囊泡的运动速度和扩散系数的统计分析后发现，花粉管内分泌囊泡处于规律性的波动状态，并且其运动模式与以前报道的花粉管中囊泡运动呈现自由布朗运动(Brownian motion)相反。为了进一步检测微丝和微管骨架在花粉管内分泌囊泡转运过程中的作用，我们分别用微丝抑制剂(Latrunculin B和cytochalasin D)和微管抑制剂(oryzalin和colchicine)处理花粉管，并对囊泡动力学参数的分析显示。结果显示，微丝骨架的破坏抑制了分泌囊泡的长距离和短距离运动，囊泡被限制在小范围内无法转运；而微管骨架的破坏对分泌囊泡的运动速度和范围影响较小。这些结果说明微丝直接控制花粉管中囊泡的转运，而微管则通过影响微丝的组装间接影响囊泡的转运。此外在花粉管顶端的近膜区，我们还观察到了由于分泌囊泡与细胞膜融合以及内涵物的释放而引起的荧光信号的逐渐消散，说明胞吐囊泡与细胞膜是完全融合(full-fusion)的。统计结果显示，发现白杆花粉管内并不存在动物细胞胞吐过程中的“kiss-and-run”模型。这一结果无疑暗示植物细胞和动物细胞胞吐过程中膜融合机制可能不同的。 本研究取得了以下创新性成果：⑴在植物活细胞中对单个分泌囊泡进行了可视化和动态追踪，发现白杆花粉管内存在长距离和短距离的运动模式；⑵以极性生长的花粉管作为研究体系，开展了胞内分泌囊泡转运的动力学特征的分析，以及微丝、微管骨架对囊泡动态的调节，结果显示分泌囊泡是沿微丝骨架转运并且其运动模式并非布朗运动；⑶结合单颗粒追踪技术(single particle tracking，SPT)对分泌囊泡在胞内分布和转运的动力学特征、胞吐过程中膜融合的动力学参数等生物学问题进行了系统的定量分析讨论，通过分析提出了胞吐过程中的“full-fusion”的新模式。利用EWM我们不仅可以对植物细胞中单个囊泡的运动进行活体动态研究，还可以用来进行细胞器以及单个分子的动态观测，从而为研究细胞生命活动的分子机制提供了新的途径。 胞间连丝作为多细胞植物有机体细胞间进行物质运输和信息传递的细胞质通道，在植物体正常有序的发育过程中起着重要作用。植物细胞与细胞之间的内源非细胞自主蛋白(non-cell-autonomous proteins，NCAPs)和病毒核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex，RNPCs)是通过胞间连丝运输的。另外细胞间的核酸、蛋白质和一些信号生物大分子通过胞间连丝在整个植物组织中实现运输和交流。由此可见，胞间连丝在植物细胞分化、植物形态发生和生长发育过程中起重要作用。因此，关于胞间连丝的结构、组成和功能的研究已经成为当今细胞生物学中十分活跃的研究领域。然而胞间连丝的构成究竟是怎样，其组成成分是什么，哪些蛋白质参与调节生物大分子通过胞间连丝的细胞间运输，迄今为止这些问题的答案都还不明确。黄瓜花叶病毒运动蛋白细胞(cucumber mosaic virus movement protein，CMVMP)可以定位至胞间连丝上，并通过改变胞间连丝的分子扩散上限(sizeexclusion limit，SEL)，使得病毒核蛋白颗粒可以通过胞间连丝在细胞间侵染。通过这一方法，我们以CMV MP通过蛋白-蛋白的互作分析，从植物细胞中筛选出可能的胞间连丝组成蛋白和结合蛋白。为此，我们利用CMV MP作为“诱饵”蛋白，从BY-2悬浮细胞中富含胞间连丝的细胞壁蛋白组分(plasmodesmataenriched cell wall proteins，PECP)中成功钓取了5个与CMV MP相互作用的蛋白，这些候选蛋白质中可能存在真正的胞间连丝组成蛋白。通过细胞学定位和免疫电镜分析，我们发现NtBiP定位于胞间连丝，而拟南芥中的两个同源蛋白--AtBIP1和AtBiP2也定位于胞间连丝上，表明与CMV MP相互作用的BiPs为胞间连丝组成蛋白。 本文通过序列和功能分析发现，BiPs为热休克蛋白Hsp70家族中定位于内质网(ER)上的分子伴侣(chaperons)蛋白。为了检测这些可以定位于胞间连丝的BiPs是否介导了生物大分子通过胞间连丝的胞间运输，我们对拟南芥中的两个胞间连丝组成蛋白AtBiP1和AtBiP2的功能进行了分析。基因枪轰击BiPs不同表达量株系的结果显示，超表达AtBiP1或AtBiP2中的任何一个蛋白，都会使胞间连丝的分子扩散上限(SEL)增大，在超表达株系中2XGFP分子可以在细胞间扩散。然而在野生型和AtBiP1和AtBiP2双突变体中我们没有检测到2XGFP分子的扩散运输。因此，我们认为AtBiP1和AtBiP2通过改变胞间连丝的SEL，而影响胞间连丝的运输能力。此外，超表达AtBiP1或AtBiP2会严重影响拟南芥的生长和发育，导致叶片严重卷曲变形、轮状叶片和花序、花发育异常甚至不育。我们推测这可能是超表达诱发的内质网胁迫(ER stress)导致的。此外，AtBiP1和AtBiP2的敲除会诱导花发育的提早，这说明基因敲除导致的胞间连丝SEL的降低，并不会限制成花过程中的关键蛋白FT(FLOWERING LOCUS T)的细胞间转运。利用CMV MP作为“诱饵”，成功地从细胞壁蛋白组分中分离鉴定了一个胞间连丝组成蛋白BiP。该BiP蛋白通过调节胞间连丝的SEL大小介导了生物大分子通过胞间连丝的细胞间转运。这一实验策略无疑为研究者发现更多的胞间连丝相关蛋白提供了理论依据和实验基础。这些研究结果有助于我们进一步揭示胞间连丝的结构组成及其调节生物大分子在植物细胞间运输的机制。
NETL