摘要
目的：食管癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，涉及多因素、多阶段、多基因变异积累及相互作用的复杂过程，在分子水平上涉及众多原癌基因、抑癌基因以及蛋白质的改变。本研究通过分析食管癌临床标本中免疫细胞及免疫分子的改变，从而阐释食管癌发生发展中的免疫病理因素和对相关治疗的指导作用。 方法： 1.收集经病理组织学或细胞学确诊的食管癌患者60例，采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血5mL，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测PBMC中Th1型转录因子T-bet mRNA和Th2型转录因子GATA-3 mRNA表达，ELISA法检测血浆中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型细胞因子IL-4、IL-10的表达。同时，对T-bet/GATA-3、Th1/Th2型细胞因子与临床病理因素的相关性进行分析。 2.收集经病理组织学或细胞学确诊的食管癌患者60例，分为单放组(单纯放疗)和艾迪组，RT-qPCR检测PBMC中转录因子T-betmRNA、GATA-3 mRNA表达，ELISA检测血浆中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达，分析两组间转录因子及细胞因子的差异和临床疗效的差异。 3.用流式细胞仪检测35例食管癌患者外周血及18例健康对照者外周血中NK、γδT细胞的百分含量及肿瘤组织中ULBP3的表达。 4.收集健康人外周血、食管癌患者外周血、癌旁组织、癌组织标本，流式细胞术检测Th17细胞水平；RT-qPCR检测RORγt、IL-17a mRNA表达水平。 5.流式细胞术检测肿瘤组织、癌旁组织及外周血Th17中CCR6+细胞所占比例。RT-qPCR和免疫组化检测肿瘤组织及癌旁组织中CCL20 mRNA水平。随机取三名食管癌患者的肿瘤组织，Transwell趋化实验检测不同浓度CCL20对肿瘤组织中Th17细胞的趋化作用。 6.通过流式细胞术检测食管癌患者外周血、癌旁组织及癌组织内Treg和Th17细胞在CD4+T淋巴细胞中的比例，分析Treg/Th17比值变化，探讨Treg和Th17细胞表达水平及Treg/Th17比值变化与各临床及病理指标间的关系；通过实时荧光定量PCR技术检测转录因子FoxP3、RORγt mRNA的表达水平，运用直线相关法对Foxp3/RORγt比值与Treg/Th17比值进行相关性分析。 结果： 1.与正常对照组比较，食管癌组Th1型转录因子T-bet和细胞因子IFN-γ、IL-2表达减低，TH2型转录因子GATA-3和细胞因子IL-4、IL-10表达增高，差异有统计学意义(P<0.01)。T-bet/GATA-3比值：正常对照组为14.03±6.02，食管癌组0.36±0.15，两组间均数比较，差异有统计学意义(P<0.01)。相关性分析：食管癌组T-bet/GATA-3比值与Th1型细胞因子IFN-γ(r=0.709)和IL-2(r=0.753)表达水平正相关，与Th2型细胞因子IL-4(r=-0.552)和IL-10(r=-0.569)表达水平负相关。 2.与放疗前比较，单放组治疗后Th1型转录因子T-bet和细胞因子IFN-γ、IL-2的表达水平显著降低，Th2型转录因子GATA-3和细胞因子IL-4、IL-10的表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。艾迪组治疗后T-bet和IFN-γ、IL-2的表达水平略降低，GATA-3和IL-4、IL-10的表达水平略升高，差异无统计学意义(p>0.05)。艾迪组与单放组治疗前后各转录因子和细胞因子表达水平变化差值比较有统计学意义(P<0.05)，显示艾迪注射液具有抑制食管癌放疗患者Th1/Th2漂移的作用。 3.食管癌患者组外周血NK细胞占淋巴细胞的比例为(22.14±12.43)％，高于健康对照组(19.11±6.99)％，无统计学差异，但0-Ⅱ期患者NK.细胞比例为(24.35±12.74)％，明显高于Ⅲ-Ⅳ期患者的(14.63±5.35)％(P<0.01)；食管癌患者外周血γδT细胞的比例为(2.80±1.49)％，较健康对照组的(5.73±4.75)％明显降低(P<0.05)，0-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期之间比较无统计学差异。食管癌组织微环境ULBP3表达明显增加。 4.食管癌患者外周血、癌旁组织、癌组织中Th17细胞水平和RORγt、IL-17a mRNA表达水平较健康人外周血均升高，且癌组织>癌旁组织>患者外周血>健康人外周血，差异有统计学意义(均P<0.05)。食管癌患者外周血中Th17细胞水平升高与患者性别、年龄、肿瘤大小无明显关系(P>0.05)，但与有无淋巴结转移和TNM分期的相关性分析显示有统计学意义(P<0.01)。 5.肿瘤组织中CCR6+Th17细胞的比例高于癌旁组织及外周血(P<0.05)；肿瘤组织中CCL20 mRNA水平高于癌旁组织，并与Th17呈正相关关系；CCL20在体外对Th17有趋化活性。 6.进展期食管鳞癌患者外周血、癌旁组织、癌组织中Treg、Th17细胞比例及FoxP3、RORγt mRNA表达均升高，且癌组织>癌旁组织>外周血，其组间差异具有统计学意义(P<0.05)，但Treg/Th17比值及Foxp3/RORγt比值在外周血、癌旁组织、癌组织中相互比较无统计学意义(P>0.05)。 7.食管鳞癌患者外周血中Treg细胞、Th17细胞、Treg/Th17比值与患者的年龄、性别及肿瘤位置、病变长度、分化程度、浸润深度无关(P>0.05)，但与淋巴结转移及pTNM分期有关(P<0.05)。 结论： 1.食管癌患者Th1/Th2漂移可能正是其发生免疫逃逸的机制之一，这种漂移趋势与肿瘤的CT分期及病变的范围有着密切的关系，而与病变的部位、病理分型及分化程度无明显相关性。 2.放射治疗加重了食管癌患者Th1/Th2漂移的倾向，中药制剂艾迪注射液配合放疗，能提高机体的抗肿瘤免疫，抑制Th1/Th2漂移，降低了毒副反应的发生率。 3.食管癌患者Th1、Th2细胞的分化受到T-bet、GATA-3的调控，其细胞分化倾向与T-bet、GATA-3的表达密切相关。 4.食管癌患者肿瘤微环境中Th17细胞水平和RORγt、IL-17a mRNA表达水平均升高，Th17细胞可能通过RORγt和IL-17a参与食管癌进展过程。CCR6-CCL20趋化轴在食管癌患者Th17浸润到肿瘤组织中发挥重要作用。 5.进展期食管鳞癌患者体内Treg/Th17细胞比例失衡，转录因子Foxp3/RORγt表达失衡可能是Treg/Th17细胞比例失衡的机制之一。
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