摘要
大黄鱼是我国的四大渔业之一，在我国渔业中有着很重要经济地位。大黄鱼和鮸鱼都是我国重要的海洋经济鱼类。但是由于近年海洋生态的破坏和种质资源的下降，使得大黄鱼的生物多样性下降，种质资源退化，品质下降，对病害和环境胁迫的防御能力下降，病害发生日趋严重，造成了巨大的经济损失。超低温冷冻保存作为一种保护种质资源的新技术，已成功的运用到海洋鱼类的精子冷冻保存中。本文主要研究了大黄鱼和鮸鱼的精子密度、活力的生理特性；研究了抗冻剂和冷冷冻速率对大黄鱼和鮸鱼精子超低温冷冻的影响，从而建立一种高效且快速的精子超低温冷冻方案；同时我们还对冷冻前后大黄鱼精子的线粒体膜电位、ATP水平、活性氧、膜完整性等进行检测，对大黄鱼精子超低温冷得出一个比较全面的精子质量评价；同时检测了鮸鱼精子线粒体膜电位、活性氧、膜完整性和受精实验，从而来评价娩鱼精子超低温冷冻的效果。 在大黄鱼精子超低温冷冻保存研究中，我们采用了挤压腹部的方法收集精子，采集到的精子呈乳白色，比较粘稠。精子密度为(3.06±0.79)×1011个精子/ml。在大黄鱼精子激活实验中，两种溶液在渗透压低于300m0sm/kg时均不能激活，在渗透压为300m0sm/kg时只能轻微激活，精子激活后的活力随着两种溶液渗透压的增高而呈“倒U”字行变化，均在渗透压为600m0sm/kg时达到最大。精子的运动时间在400m0sm/kg时最大，之后随着渗透压的逐渐增高，精子的运动时间逐渐降低。鲜精的短期保存实验中，大黄鱼的精子使用Free组、Pyr组、Lac组和Glc组处理后，在4℃冰箱内保存16小时精子活力未出现明显的下降。Free组在保存48小时后，精子活力下降为0，而其他三组的活力均大于60％。在保存72小时后Pyr组、Lac组和G1c组的精子活力也降为0。Pyr组的精子运动时间明显比其他几组要长。说明外源能量物质在精子离体保存有着很重要的作用。 在大黄鱼精子超低温冷冻方案筛选中，我们选用了三种抗冻剂：DMSO、Gly和EG；每种抗冻剂选择4个浓度：5％、10％、15％和20％；精子的冷冻采用了四个不同高度的泡沫船1、3.4、5、7cm来控制得到四种冷冻速率。使用DMSO作为抗冻剂时，在5％和10％的浓度时，都获得活力>75％的效果；在DMSO浓度较高时(15-20％)，5cm和7cm高度泡沫船的冷冻效果明显差与1cm和3.4高度；在10％的浓度1cm泡沫船高度下，获得了86.7±2.9％的最高活力。精子的运动时间随着泡沫船高度的增高而呈明显的降低趋势，在10％的浓度1cm高度时获得了229±14.8s的最长运动时间。使用EG作为抗冻剂时，20％浓度的精子活力显著低于5％组、10％和15％三组；1cm、3.4cm和5cm都获得活力≥80％，都显著高于7cm组；在5％的浓度1cm高度时获得了93.3±2.9％的最高活力；随着泡沫船高度的增加，精子的运动时间也呈现逐渐降低的趋势，在15％的浓度1cm高度时获得了281.5±20.5s的最长运动时间。使用Gly作为抗冻剂时，随着浓度的增加，精子解冻后的活力都逐渐降低；随着泡沫船高度的增高，精子活力呈逐渐减低的趋势；使用1cm高度的泡沫船，5％Gly进行冷冻取得了最高的活力86.7±2.9％；并没有表现出很好的规律和趋势。在15％Gly，5cm高度的泡沫船冷冻时获得了最高的精子运动时间246.5±43.1s，但与5％浓度1cm高度并没有显著性差异(P=0.284)。总之，5％DMSO、5％EG和5％Gly在1cm高度快速冷冻大黄鱼的精子均获得了很理想的效果。 本文对大黄鱼的精子冷冻前后进行了全面的评价，发现冷冻导致了大黄鱼精子线粒体膜电位的和细胞内的ATP含量明显降低，并且冷冻过程造成大量精子质膜的破裂，诱导细胞内ROS的大量产生。但是DMSO与EG对精子的保护，在不同方面都有他们各自的优势，DMSO对冷冻过程ATP的保护和防止ROS的生成都要好于EG，但对MMP的保护EG则更好，对MI的保护两者都相差无几。 对鮸鱼精子超低温冷冻的研究中，使用了与大黄鱼同样的精子采集方法，CASA检测了6条鮸鱼的鲜精精子密度，平均密度为(6.39±2.23×1010)个精子/ml。本文根据实验室前辈的研究结果，选择了两种效果比较好的抗冻剂：DMSO和EG；每种抗冻剂选择4个浓度：5％、10％、15％和20％；精子的冷冻采用了四个不同高度的泡沫船1、3.4、5、7cm来控制得到四种冷冻速率。使用DMSO作为抗冻剂时，在5％-10％的浓度是都获得了大于70％的精子活力，10％DMSO的冷冻-解冻后的精子活力显著高于其他三组。在1cm高度，5％的浓度下获得了85％的最高的精子活力。使用EG作为抗冻剂时，1cm泡沫船的冷冻后精子活力明显高于其他三组，在5％的浓度是获得了83.3±2.9最高的精子活力。鮸鱼的受精实验我们发现，随着精卵比的减少，受精率也呈下降的趋势，在精卵比为107:1，鲜精和冻精的受精率没有明显的差别。当精卵比为106:1时，DMSO组的受精率高于鲜精组和EG组，DMSO组和EG组之间没有显著性差异。在精卵比为103:1时，EG组显著低于其他两组，两组之间没有显著性差异。说明DMSO的效果要好于EG。这与后面的精子质量评价的结果相一致，DMSO对于线粒体膜电位和质膜的保护都要好于EG。精子的受精能力和精子质量评价的结果有一定的正相关。
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