摘要
蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)是兰科蝴蝶兰属植物，花色艳丽，形如蝴蝶，是世界著名的观赏花卉之一，但目前蝴蝶兰的主栽品种基本上没有香味，培育具花香的蝴蝶兰新品种具有广阔的市场前景。LlDXR、HcTPS1和CeAOC分别是本课题组从百合、姜花和建兰花中克隆并鉴定与花香化合物合成密切相关的基因，通过构建单基因植物正义表达载体，采用农杆菌介导法转化丛生芽和花粉与农杆菌共培养再授粉的方式进行遗传转化。主要研究结果如下： 1、利用pCAMBIA1300G植物表达载体构建了具有花部特异表达功能的HcTPS1启动子和合成挥发性香气物质沉香醇的HcTPS1的pD-TPS1植物正义表达载体。 2、蝴蝶兰‘香妃’丛生芽诱导阶段和分化阶段Hyg适宜筛选浓度为10 mg/L；根对Hyg最为敏感，出根阶段不加为宜；Car适宜浓度为400-500 mg/L。浸染时间和共培养时间分别为30 min和6d，菌液OD600为0.6-0.8，AS浓度为100 mm/L时受体材料存活状态最好。对285个丛生芽受体进行转化，获得12个抗性丛生芽；改良SDS法有较高的DNA获得率，能满足PCR扩增的需要；对抗性材料进行PCR检测，其中PCR阳性材料有2个单芽，初步证明了外源DXR和AOC己整合到抗性材料的基因组中。 3、研究了蝴蝶兰‘V3’花粉块成熟度、花粉块AAM培养液中浸泡时间和花朵成熟度对授粉结荚率的影响，以花开后5d的花粉进行授粉的结荚率最高，0.5 h为花粉浸泡时间为最佳，开花后5d的花朵进行授粉结荚率达到最高66.66%。 4、采用蝴蝶兰‘V3’未经转化的种子进行培养基的筛选，最佳培养基为1/2MS+100 mg/L椰汁，其种子萌发率在70%以上；将未经转化的蝴蝶兰种子播种于含有不同浓度抗生素Hyg的培养基进行筛选，蝴蝶兰种子抗生素筛选浓度为5 mg/L。 5、利用构建的pD-TPS1，pOx-DXR和pMOGMON-AOC植物表达载体，采用农杆菌介导法，对蝴蝶兰‘V3’花粉的遗传转化再进行授粉，AOC侵染后的结荚率最高为34.58%，DXR侵染后的结荚率为32.78%，TPS1侵染后的结荚率为27.29%。将基因转化的蝴蝶兰种子播种于抗生素培养基上，经过两次潮霉素筛选，对36个抗性材料进行PCR检测，其中PCR阳性植株有6株，其中转化LlDXR3株，CeAOC2株，HcTPS11株，初步证明了外源LlDXR、HcTPS1和CeAOC己整合到抗性材料的基因组中。 6、经固相微萃取.气相色谱质谱分析测定，转LlDXR蝴蝶兰叶片中新生成了单萜类物质α-蒎烯、α-水芹烯、柠檬烯、萜品油烯、沉香醇、倍半萜类物质α-石竹烯、杜松烯、α-桉叶烯、γ-桉叶烯和二萜(E)-Biformene，此外，倍半萜依兰烯含量有所增加。
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