摘要
糖皮质激素是治疗炎症及自身免疫性疾病的常见药物。内源性及外源性合成的糖皮质激素均能有效抑制炎症反应，纠正炎症反应的失衡，避免过度或持续炎症所引起的组织损伤。正由于疗效显著，糖皮质激素数十年来一直应用于临床一线，广泛用于败血症性休克、哮喘、炎性肠病、类风湿性关节炎和多发性硬化症等炎症相关性疾病的治疗。然而，由于长期使用所带来的副作用及日益增加的耐药性，糖皮质激素的临床效能正面临前所未有的挑战。因而，深入研究和进一步阐明糖皮质激素的作用机理是一项重要的科学问题。 长期以来广为人们认可的糖皮质激素作用机制是基因组学说，即：通过与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)结合形成复合物，转位进入细胞核后，与靶基因启动子区域糖皮质激素反应元件(Glucocorticoid responsive element，GRE)结合或者与转录因子相互作用，从而直接或间接调控靶基因的转录。以往的研究主要聚焦在信号分子及炎症介质等蛋白编码基因上，而对于与基因表达异常关系密切的非编码序列如microRNAs(miRNAs)的作用则知之甚少。 近年来，miRNA已成为基因表达调控的“明星”分子。它们由细胞内核基因组转录为RNA，经过Drosha和Dicer酶剪切加工后，成为成熟的miRNA。成熟miRNA的种子序列可与靶基因mRNA的3’端非编码区互补结合，导致mRNA降解或者蛋白翻译抑制。越来越多的证据表明：miRNA是机体内各种生理及病理活动的关键调节因子，并参与固有免疫应答及适应性免疫应答。Toll样受体(Toll like receptor，TLR)是固有免疫细胞重要的识别受体，可结合病原体的特定结构成分，从而激活免疫细胞。其中，TLR4信号通路的活化，诱导大量不同的miRNA，例如miR-146a，miR-147，let-7e，let-7j和miR-155表达上调等；而这些miRNA又可靶向抑制某些信号传导蛋白的表达，反馈调控TLR4信号通路的强度，从而促进或者抑制炎症应答。这些研究结果提示：miRNA在炎症应答中扮演着重要角色。那么，糖皮质激素是否调控miRNA的表达?miRNA是否参与糖皮质激素的抑炎作用?作用机制又如何?目前，均未见系统的研究报道。 有鉴于此，我们以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应模型为研究对象，利用基因芯片等技术系统分析了糖皮质激素地塞米松对miRNA表达谱的改变情况，并对糖皮质激素调控miRNA表达的机制、miRNA参与糖皮质激素抑炎的作用及分子机制展开研究，以期阐明糖皮质激素抗炎的非编码RNA机制，为后续的药物开发提供理论和实验基础。 第一部分糖皮质激素影响microRNAs在炎症反应中的表达 巨噬细胞是天然免疫系统的重要组成部分，在炎症反应中起十分关键的作用。巨噬细胞等炎症细胞渗出是炎症反应最主要的特征。渗出的巨噬细胞是一柄双刃剑，一方面，巨噬细胞被激活后，释放炎性介质，激活免疫系统，有效地杀伤病原体，构成炎症反应的防御环节；另一方面，巨噬细胞过度激活则释放过量炎性介质、蛋白水解酶及氧自由基等加重组织损伤并延长炎症过程。Raw264.7细胞是小鼠来源的单核巨噬细胞系，在受到LPS刺激时，可模拟机体炎症细胞的反应状态，已成为一种常见的炎症反应细胞模型被广泛应用于炎症领域的相关研究。 据此，我们首先以LPS刺激Raw264.7细胞建立炎症反应模型，加入糖皮质激素地塞米松24h后，用Realtime PCR检测细胞炎症介质表达水平的改变，并用ELISA检测细胞外炎症介质的释放情况，结果发现：地塞米松可在mRNA水平下调TNF-a、IL-6及iNOS的表达，抑制丁NF-a、IL-6及NO的合成及释放，提示糖皮质激素可显著抑制LPS所介导的巨噬细胞炎症反应。 为了进一步研究糖皮质激素对miRNA表达谱系的影响，我们以上述炎症模型为基础，利用基因芯片技术，系统分析了糖皮质激素对miRNA表达的调控作用，结果发现：LPS可上调巨噬细胞内96个miRNA的表达，下调30个miRNA的表达；在加入地塞米松后，与LPS+DMSO组相比，可上调巨噬细胞内96个miRNA的表达量，而下调的miRNA数量则为137个。通过生物信息学分析，我们挑选了其中部分与炎症密切相关的miRNA及表达差异较大的miRNA进行Realtime PCR的验证，结果显示：糖皮质激素可显著下调miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301b的表达，而对let-7i及let-7e的表达无明显影响。 本部分实验结果表明，糖皮质激素除了调控编码蛋白基因表达外，对蛋白非编码的miRNA亦具有明显的调控作用。 第二部分 糖皮质激素下调mieroRNA-155发挥抑炎作用 第一部分的结果表明糖皮质激素可以明显影响miRNA的表达谱系的变化，那么miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301等这些变化的microRNA在糖皮质激素抑制炎症反应中的作用如何?为此，我们首先采用电转染的方法分别转染miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301模拟物(mimics)以上调这些miRNAs在巨噬细胞内的表达；其后，再进行地塞米松处理及LPS刺激。结果发现：过表达miR-155可显著拮抗地塞米松对TNF-a、IL-6及NO等炎症介质的抑制作用，提示miR-155参与糖皮质激素抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的作用。 为了进一步探讨这种下调的miR-155表达对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的影响，我们利用miR-155抑制剂(inhibitor)干扰Raw264.7巨噬细胞内miR-155的表达后，再进行LPS刺激，结果发现：miR-155表达的下调可削弱LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。该作用与糖皮质激素的作用一致，表明下调miR-155的表达是糖皮质激素抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的重要分子机制。 miRNA发挥作用的经典模式是与靶基因mRNA的3’端非编码区互补结合，导致蛋白翻译抑制。为进一步探讨miR-155参与糖皮质激素抑制巨噬细胞炎症反应的分子机制，我们利用生物信息学对其可能的靶基因进行科学预测和初筛，结果发现：PicTar，Target Scan及miRanda等三个数据库信息搜寻及交集运算分析发现了83个miR-155潜在靶基因；在这些靶基因中，SOCS1是具有显著抑炎功能的分子，因此我们进一步对其进行分析及实验验证。双荧光素酶报告基因检测发现：miR-155可抑制含SOCS13’UTR序列报告基因质粒的荧光素酶活性；Western blot检测亦发现，在Raw264.7细胞中，miR-155 mimics可显著下调SOCS1蛋白水平的表达。这些结果表明，SOCS1是miR-155的靶基因。此外，我们还进一步研究了地塞米松对SOCS1基因表达的影响，LPS刺激的Raw264.7细胞炎症反应模型，经糖皮质激素地塞米松干预后，western blot检测Raw264.7细胞中SOCS1蛋白水平的表达，结果发现地塞米松可上调SCOS1的表达。 本部分结果表明，miR-155参与糖皮质激素抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应；下调miR-155的表达从而上调其靶基因SOCS1的表达，是糖皮质激素发挥抗炎作用的重要机制之一。 第三部分 糖皮质激素对microRNA-155的调控机制研究 为进一步明确糖皮质激素对miR-155表达的调控作用，我们在LPS诱导的原代小鼠腹腔巨噬细胞及人THP-1单核细胞炎症模型基础上进一步验证糖皮质激素对miR-155表达的影响。结果发现，与在Raw264.7细胞中的研究结果一致，糖皮质激素地塞米松对原代巨噬细胞及人单核细胞中LPS诱导的miR-155表达亦有显著抑制作用。此外，我们进一步以LPS建立动物炎症模型，经地塞米松处理后，检测脾脏及肝脏中miR-155的表达情况。结果发现，与对照组相比，地塞米松处理组小鼠脾脏及肝脏中miR-155的表达量亦发生下调。这些结果提示：糖皮质激素对miR-155的调控作用具有一定的广泛性，而非单一的细胞依赖性。 糖皮质激素发挥作用主要通过经典的受体依赖途径及受体非依赖途径。为进一步探讨糖皮质激素对miR-155表达调控的机制，我们以糖皮质激素受体阻断剂RU486预处理Raw264.7细胞后，再加入地塞米松及LPS，结果发现：RU486可完全阻断地塞米松对miR-155表达的影响。结果提示，糖皮质激素对miR-155表达的调控作用具有受体依赖性。 MAPK及NF-κB通路是LPS激活TLR4后发挥功能的重要信号传导途径。为研究糖皮质激素对miR-155表达调控的分子机制，我们首先探讨糖皮质激素对MAPK及NF-κB通路的影响。结果发现，地塞米松可显著抑制LPS所介导的MAPK家族中p38的磷酸化，而对ERK及JNK的磷酸化无明显影响；此外，地塞米松亦可抑制LPS所介导的p65核转位。为进一步探讨p38及NF-κB通路在LPS诱导的miR-155表达中的作用，我们采用p38抑制剂SB203580阻断p38通路后，LPS仍可上调miR-155的表达，且表达量未见明显改变；相反，采用NF-κB抑制剂BAY11-7082阻断NF-κB通路后，LPS所诱导的miR-155表达量发生下降，提示NF-κB通路而非p38通路参与LPS所介导的miR-155表达上调。因此，这些结果表明：地塞米松主要是通过抑制NF-κB通路的激活从而影响LPS所介导的miR-155表达。 Pri-miR-155及pre-miR-155是成熟miR-155的前体，我们在LPS诱导的巨噬细胞炎症反应模型上检测糖皮质激素对pri-miR-155及pre-miR-155表达的影响，结果发现：地塞米松可显著下调LPS所诱导的pri-miR-155及ore-miR-155表达。这提示，地塞米松对miR-155的抑制作用可能发生于转录起始水平。因而，我们对miR-155宿主基因BIC(B-cell integration cluster)的启动子序列进行分析。对BIC的转录起始位点上游5000bp至下游500bp的DNA区域的分析的结果显示，在该区域不含糖皮质激素的直接结合位点GREs；相反，在该区域里存在NF-κB、AP-1及Ets-1等结合位点；当NF-κB位点发生突变时，地塞米松对miR-155表达的抑制作用消失。这些结果表明，BIC上NF-κB结合位点以及NF-κB通路是地塞米松是于LPS诱导的巨噬细胞炎症反应模型上调控miR-155表达的关键位点及关键信号分子途径。 综上所述，我们首次系统分析了糖皮质激素对miRNA表达谱系的影响，发现miR-155参与糖皮质激素抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应；糖皮质激素可通过受体依赖途径及NF-κB通路抑制LPS诱导的miR-155转录，下调miR-155的表达水平，从而上调其靶基因SOCS1的表达，进而发挥抑制炎症反应的作用。该研究结果进一步丰富了糖皮质激素的作用机制，为后续药物的开发提供了新的靶点及实验基础。
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