摘要
目的：阿片受体主要分为3种亚型，即μ、δ、κ阿片受体，其中κ阿片受体通过与特异性配体强啡肽结合参与产生机体镇痛、神经内分泌、情感行为、认知等生理活动[1]，并且参与吗啡依赖的形成及戒断后负性情绪的产生。研究证实强啡肽/κ阿片受体系统在物质成瘾[2]中可以抑制中脑边缘多巴胺神经系统功能，从而发挥其在吗啡依赖及戒断过程中的作用。 八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)是中枢神经系统内含量最高、作用最强的抗阿片肽，参与调节机体疼痛、认知、奖赏和学习记忆过程。有报道证实[3]CCK-8可以翻转κ阿片受体参与介导的镇痛作用。然而，有关CCK-8与κ阿片受体在吗啡依赖及戒断过程中的相互作用尚未见报道。 本研究通过建立吗啡依赖和戒断细胞模型，观察CCK-8对吗啡依赖及戒断过程的影响，并且观察CCK-8是否通过对强啡肽/κ受体系统的调节进而参与了吗啡依赖和戒断过程，以进一步明确CCK-8参与吗啡依赖和戒断的具体机制。 方法： 1以100μM吗啡作用48 h建立PC12细胞吗啡依赖模型，并给予10μM纳洛酮作用15 min进行催促戒断，采用时间分辨免疫荧光分析法检测细胞内cAMP水平，以cAMP超射为指标鉴定细胞模型是否成功。给予不同浓度CCK-8(10-12-10-6M)与100μM吗啡共同孵育细胞48 h后，10μM纳洛酮作用15 min进行催促戒断，观察CCK-8对吗啡依赖及戒断细胞模型的影响，并且单独给予CCK-8作用48 h，观察CCK-8本身对cAMP水平的影响。 2应用Real-Time PCR技术观察吗啡依赖及戒断PC12细胞模型中κ阿片受体、强啡肽原(PDYN)及CCK1和CCK2受体mRNA水平的改变；同时，在建立吗啡依赖及戒断细胞模型的基础上，观察不同剂量的CCK-8对κ阿片受体及强啡肽原mRNA的影响，以探讨CCK-8是否通过对强啡肽/κ受体系统的调节进而参与了吗啡依赖和戒断过程。首先100μM吗啡作用48小时建立吗啡依赖模型100μM吗啡作用48小时后给予10μM纳洛酮作用15分钟建立吗啡戒断模型。观察上述模型中κ受体、PDYN、CCK1受体以及CCK2受体的mRNA的表达变化。其次，以不同浓度的CCK-8(10-12-10-6M)分别单独作用或作用于吗啡依赖及戒断PC12细胞48小时，以观察不同剂量CCK-8对吗啡依赖及戒断模型中κ受体及PDYN mRNA表达的变化的影响。 结果： 1100μM吗啡作用于PC12细胞48 h后给予101μM纳洛酮作用15min，可见PC12细胞内cAMP含量增加至3.98±0.26 pM，与空白对照组2.75±0.37 pM及吗啡依赖组3.16±0.10pM相比较有明显差异，形成了cAMP超射，证实吗啡依赖戒断细胞模型建立成功。 2100μM吗啡作用于PC12细胞48 h、10μM纳洛酮催促戒断15min后，κ受体、PDYN以及CCK1和CCK2受体mRNA均明显上调，与对照组相比具有统计学意义。 3不同浓度CCK-8(10-12-10-6M)与100μM吗啡共同孵育PC12细胞48小时后，给予10μM纳洛酮作用15 min，诱导cAMP超射的形成。结果显示，10-7、10-6M的CCK-8可明显抑制慢性吗啡孵育后纳洛酮催促戒断细胞模型的cAMP超射，与吗啡戒断组相比具有统计学意义；而10-12、10-10、10-8M的CCK-8对cAMP含量无明显影响。单独给予不同浓度CCK-8(10-12-10-6 M)孵育细胞48 h对cAMP无明显作用。 410-7、10-6M的CCK-8与吗啡共同孵育PC12细胞48小时，可明显降低κ受体及PDYN mRNA的表达水平，与吗啡依赖组相比具有统计学意义。10-12、10-10和10-8 M的CCK-8对κ受体及PDYN mRNA表达无明显影响。单独给予10-7、10-6 M的CCK-8作用于PC12细胞48小时同样可降低κ受体及PDYN mRNA的水平，而10-12、10-10、10-8 M的CCK-8对κ受体及PDYN mRNA水平无明显影响。 510-7、10-6 M的CCK-8与吗啡共同孵育PC12细胞48小时后给予10μM纳洛酮作用15分钟，可明显抑制κ受体及PDYN mRNA水平在吗啡戒断后的上调，与吗啡戒断组相比具有统计学意义。10-12、10-10和10-8M的CCK-8对κ受体及PDYN mRNA表达无明显影响。 结论： 1本实验以“cAMP”超射做为观察指标，成功建立了吗啡依赖和戒断细胞模型。 2在吗啡依赖及戒断细胞模型基础上，给予CCK-8干预可显著抑制吗啡依赖及戒断的形成，且呈剂量依赖性。 3在吗啡依赖及戒断细胞模型中K阿片受体及强啡肽原mRNA表达增加，CCK-8可剂量依赖地降低κ阿片受体及强啡肽原mRNA的表达，提示CCK-8可能通过抑制κ阿片受体及强啡肽原的表达抑制吗啡戒断的发生。
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