摘要
颠茄是我国药典规定托品烷类生物碱来源的唯一药用植物,也是莨菪碱、东莨菪碱最主要的商业药源(国家药典委员会2011版)。与莨菪碱相比,东莨菪碱副作用小、药理作用强,所以需求量十分巨大。野生颠茄中东莨菪含量非常低,而在商用栽培颠茄中,东莨菪碱含量也仅为干重的0.01-0.08%。近年来,随着托品烷类生物碱生物合成途径分子生物学研究的深入,使得在分子水平实现包括莨菪碱和东莨菪碱在内的TAs生物合成的代谢调控取得了重要进展。特别是目前东莨菪碱代谢途径上的一些功能基因的确定,为利用托品烷类代谢工程技术提高颠茄中东莨菪碱含量打下了基础。 在托品烷类生物碱代谢途径中,pmt、trI和h6h是重要的基因。其中,pmt为上游重要基因,trI为中间分支点基因,h6h为下游重要基因。研究表明,在颠茄毛状根和颠茄植株中,外源pmt、trI、h6h的高度表达对莨菪碱和东莨菪碱含量的变化都是有所相关的:将烟草pmt基因转入白曼陀罗,莨菪碱的含量提高2倍多,东莨菪碱的含量提高3倍多;在颠茄中高度表达曼陀罗trI,莨菪碱的含量提高了3倍多,东莨菪碱的含量提高了5倍多;将莨菪的h6h导入到埃及莨菪中,最好的克隆产生了17mg/L的东莨菪碱,是对照克隆的100倍以上。而内源基因在其中的作用尚不清楚。针对这点,在之前研究基础上,本文通过内源pmt、trI、h6h的双基因策略研究对颠茄毛状根莨菪碱和东莨菪碱含量的影响。 分别构建携带目的基因的植物高效双元表达载体p1304+-pmt-trI、p1304+-pmt-h6h和p1304+-trI-h6h,转化“卸甲”的根癌农杆菌C58C1获得工程菌C58C1-p1304+-pmt-trI、C58C1-p1304+-pmt-h6h和C58C1-p1304+-trI-h6h,遗传转化颠茄叶片。在C58C1-p1304+-pmt-trI组合中,经检测rolC、hygr和pmt、trI基因后成功筛选出6个转基因发根系,分别进行液体培养基扩大培养然后检测托品烷类生物碱(Tas)含量和基因表达量。其中有4个发根系的总Tas含量得到了提高,依次为PT11＞PT17＞PT13＞T3,PT11的总Tas含量约为空菌发根对照(NC)的2.5倍;有2个发根系的含量维持不变或明显降低,但东莨菪碱的含量有所提高。莨菪碱和东莨菪碱含量提高最多的PT11相比空白对照分别提高了2倍和5.7倍。基因表达量上,除了FT2的pmt基因表达量较空白发根低,其他转基因发根系的pmt和h6h基因的表达量都比空白对照高。在C58C1-p1304+-pmt-h6h组合中,经检测rolC、hygr和pmt、h6h基因后成功筛选出5个转基因发根系,分别进行液体培养基扩大培养然后检测Tas含量和基因表达量。其中有2个发根系的总Tas含量得到了提高,为PH2＞PH14,PH2的总Tas含量约为空菌发根对照(NC)的2.7倍;有3个发根系的含量维持不变或明显降低,但东莨菪碱的含量有所提高。在这5个发根系中,莨菪碱和东莨菪碱含量提高最多的PH2比空白对照分别提高了1.8倍和8.2倍。除了PH32的pmt基因表达量低于空白对照,其余转基因发根系的pmt和h6h基因表达量都有所提高或持平。在C58C1-p1304+-trI-h6h组合中,经检测rolC、hygr和trI、h6h基因后成功筛选出4个转基因发根系,分别进行液体培养基扩大培养然后检测TAs含量和基因表达量。其中有3个发根系的总TAs含量得到了提高,为HT2＞HTA1＞HTA3＞HT16,HT2的总Tas含量约为空菌发根的2.6倍;有1个发根系的含量降低,但东莨菪碱的含量有所提高。莨菪碱和东莨菪碱含量提高最多的HT2比NC分别提高了2.1倍和5.6倍。HT2的h6h表达量为最高,其东莨菪碱含量也为最高,HTA1、HTA3、HT16的h6h基因表达量与NC接近,但trI基因的表达量有很大的提高。上述基因的具体表达量与含量水平之间并不完全一致,这可能是由于双转的基因在表达上产生了共抑制,使转基因发根在基因的高表达下反而含量保持不变或有所降低。但总体上,双基因策略在托品烷类生物碱合成途径中可能存在协同作用。转基因发根个体间托品烷类生物碱合成能力有个体差异,但是并没有改变两个基因过量表达能够提高东莨菪碱含量的趋势,说明双基因的遗传转化能够打破颠茄托品烷类生物碱合成途径中的限速反应步骤,从而推动代谢流更多的向托品烷类生物碱合成方向流动,提高了莨菪碱和东莨菪碱合成能力,最终表现为两者含量的提高。 pmt是东莨菪碱生物合成途径中的第一个重要酶基因,其过量表达能够为下游的东莨菪碱合成提供更为充足的前体物质;trI是东莨菪碱生物合成途径中的一个分支点,使代谢流更多的流向东莨菪碱;h6h是该途径中的最后一个重要酶基因,其超量表达能够高效转化来至于途径上游提供的代谢流,合成东莨菪碱。本研究的实验结果证明了颠茄内源pmt、trI和h6h在颠茄托品烷类生物碱合成途径中具有提高总Tas作用,为进一步开展颠茄的Tas代谢工程提供了理论支持。
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