摘要
竹节参(PanaxiaponicusC.A.Meyer)是我国民间珍贵的传统中草药之一,被誉为“草药之王”。由于近年来对竹节参的掠夺性采挖,导致野生竹节参资源储量极聚下降,无法满足市场的需求。因而,建立和优化竹节参再生体系,利用基因工程手段改善竹节参三萜皂苷代谢合成途径,为保存和优化该种质资源提供基础的理论数据。 竹节参主要有效药用成分为皂苷,而鲨烯合酶(squalenesynthase)是三萜皂苷代谢途径中的关键酶基因之一,是催化法呢基焦磷酸(FPP)向三萜皂苷和植物甾醇代谢的第一关键节点,在三萜皂苷代谢中起着重要的作用。随着毛状根技术体系的完善和毛状根本身的优良特性,利用毛状根作为生物反应器来高效合成一些有价值的代谢产物和利用毛状根研究生物代谢途径显示出了广泛的应用前景。本文验证了SS基因在毛状根中皂苷代谢途径中的功能,为SS基因转入竹节参毛状根获得高产皂苷的竹节参毛状根系奠定基础。 应用正交设计法探索竹节参离体培养与植株再生技术及优化培养条件,分别以竹节参的胚、茎、叶作为外植体,筛选出竹节参最佳的愈伤组织诱导和分化培养基。竹节参不同外植体的最优消毒方法分别为,种子消毒采用75%酒精浸泡60s,0.1%HgCl2浸泡12min;茎和叶片采用75%酒精浸泡15s,5%次氯酸钠浸泡5min。光照条件下愈伤组织诱导的最佳培养基配方是,胚用MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L2,4-D+0.1mg/LKT;茎用MS+1.5mg/LNAA+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/LKT,叶为MS+1.5mg/LNAA+1.0mg/L2,4-D+0.2mg/LKT;黑暗条件下,胚为MS+1.0mg/LNAA+1.5mg/L2,4-D+0.2mg/LKT,茎为MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L2,4-D+0.1mg/LKT,叶为MS+1.5mg/LNAA+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L。丛芽诱导最佳培养基为MS+3.0mg/L6-BA+1.0mg/LGA3。生根诱导最佳培养基为MS+1.0mg/L6-BA+3.0mg/LIBA。经优化的竹节参再生体系极大的提高了竹节参种苗资源量。 为研究竹节参SS基因在毛状根中的功能,实验根据已知的竹节参SS基因序列采用RT-PCR扩增获得目的基因,并将SS基因连接到双元植物表达载体pCXSN上,经酶切验证和测序验证获得了全长正向插入和反向插入两种重组载体,并将正向插入的重组载体pCXSN-SS导入携带有pRiA4的发根农杆菌C58C1中,获得可以使转化毛状根携带外源SS基因的工程菌。利用获得的工程菌通过农杆菌介导转化烟草产生毛状根,毛状根经潮霉素筛选和严格的分子检测在DNA水平上获得阳性转化毛状根系,通过RT-PCR检测竹节参SS基因在野生烟草植株、C58C1诱导的野生型烟草毛状及转SS基因的毛状根系中的转录水平,结果表明转SS基因的毛状根系中的SS基因转录水平明显高于野生型烟草和野生型毛状根中的SS基因的表达水平,最终共检测出13个转入外源SS基因的毛状根系,转化率达40.63%。 采用正交设计的方法以竹节参根茎为材料,探讨提取液、料液比、提取时间和提取次数对竹节参中人参皂苷Re提取效率的影响。经筛选竹节参根茎粉末用75%甲醇水,料液比为每100mg/3ml,提取时间45min,提取次数以2次最佳,人参皂苷Re的得率最高。采用分光光度法以人参皂苷Re为对照品,分别测定了野生烟草、野生型发根农杆菌诱导的烟草毛状根及10个转入竹节参SS基因的烟草毛状根,转入SS基因的毛状根中的总皂苷含量是野生型毛状根的1.67-2.8倍,是野生烟草的2.76-4.62倍。竹节参SS基因在烟草毛状根中的超量表达,可以提高烟草毛状根中皂苷的含量。
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