摘要
结核病死灰复燃,是一种严重危害人类健康的传染病。2010年,估算全球新发结核病患者880万例,未感染艾滋病的结核病患者死亡人数为110万,另有35万死于艾滋病病毒感染相关结核病。随着人类社会和药物治疗的发展,人们对结核病的致病菌——结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的生物学特性有了进一步的研究,继而研发了链霉素、异烟肼、利福平等治疗性药物,使得人类对结核病的控制取得了可喜的成绩,遏制了结核病的蔓延和传播。1995年至2010年间,在实施了现代结核病控制策略/遏制结核病策略的结核病防治规划中,5500万例结核病患者得到了治疗,4600万例患者获得成功治疗,这些治疗挽救了近700万人的生命。然而由于化学药物的不合理应用、艾滋病与结核病共感染、人口流动的增加以及耐药结核病菌的流行,使得近年来结核病疫情下降缓慢,在部分地区甚至有所回升。当前,在结核病控制工作中急需有效的预防性、治疗性疫苗和新型药物。寻找新的药物作用靶点和开发新型抗结核药物已成为当前最为关注的焦点。 whi基因普遍存在于放线菌属和分枝杆菌属中,因其突变能导致天蓝色链霉菌菌落呈白色而得名。whiB是whi基因中的一类,其编码的蛋白功能涉及孢子形成、细胞分裂、致病性以及营养缺陷等压力传感。经ProteinSequenceAnalysis(PSA)server分析显示WhiB样具有helix-turn-helix(HTH)基序,是可能的转录调控因子。结核分枝杆菌具有7个WhiB-like蛋白(WBL),为WhiB1～7。序列分析显示这些WBL都具有四个保守的半胱氨酸残基,且排列为“C-X19-36-C-X-X-C-X5-7-C”,C-X-X-C可以和[2Fe-2S]配位。通过同源性分析,发现除了WhiB5和WhiB6,结核分枝杆菌中其它5个WhiB蛋白在分枝杆菌属中的同源性都很高。但是结核分枝杆菌7个WBL蛋白的功能还没有完全诠释。与胰岛素共孵育检测蛋白的二硫键还原功能,结果表明除了WhiB2,其他6个WhiB蛋白都能够还原胰岛素的二硫键。WhiB1是唯一的在结核分枝杆菌中被发现的受cAMP受体蛋白CRP调控的蛋白,能够与结核分枝杆菌体内最佳生长所必需的基因glgB相互作用。WhiB3与组织损伤有关,且结核分枝杆菌调节whiB3的表达来应对体内的环境信号。M.tuberculosisH37Rv的whiB7无效突变菌株对多种抗生素(四环素,林可霉素,红霉素)高度敏感,表明WhiB7蛋白与压力传感有关。在M.tuberculosisCDC1551中检测7个WbL在不同抗分枝杆菌因子和其它的压力条件下的表达情况,结果表明作用于核糖体的氨基苷类一链霉素和卡那霉素一刺激whiB7的表达。在PH4.5的酸性条件下,whiB6和whiB3的表达特异性增高 在耻垢分枝杆菌中过表达WhiBTM4,导致耻垢分枝杆菌表现出WhiB2敲除表型,即阻碍隔膜的形成,表明WhiBTM4下调WhiB2。研究表明结核分枝杆菌WhiB2蛋白与耻垢分枝杆菌WhmD蛋白的功能是相同的。whmD是必需基因,耻垢分枝杆菌染色体上whmD的缺失导致不可逆的,分枝生长呈现减少的隔膜形成,说明该基因和细胞分裂有关,但是与细胞分裂相关的具体机制目前尚不清楚。为了研究WhiB2与细胞分裂的机制及其功能,本研究将结核分枝杆菌whiB2基因克隆到穿梭质粒pNIT-myc中,得到重组质粒pNIT-myc-whiB2,再用电穿孔的方法将重组质粒转入耻垢分枝杆菌中得到过表达WhiB2蛋白的耻垢分枝杆菌重组菌株。然后研究whiB2的过表达对耻垢分枝杆菌的生长,对过氧化氢的敏感性及对与细胞分裂有关基因的表达的影响,检测了抗分枝杆菌抗生素对耻垢分支杆菌的MIC。结果表明whiB2的过表达对耻垢分枝杆菌的生长并没有什么影响,却使耻垢分枝杆菌增加了对异烟肼和卷曲霉素的敏感性,而对过氧化氢的耐受性明显增加。RT-PCR结果显示WhiB2的过表达使与细胞分离有关的基因MSEMG_4225和ftsZ的表达量增加。荧光显微镜分析显示WhiB2蛋白的过表达使得细胞分裂加快。总而言之,我们的研究表明了结核分枝杆菌WhiB2与抗生素和氧化物过氧化氢的关系,进一步揭示了WhiB2与细胞分裂的机制,为了解结核分枝杆菌的生理生化现在提供了进一步的依据。
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