摘要
背景和目的： 大量研究显示,循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)的检测有助于早期发现肿瘤微转移、监测术后复发、评估疗效及预后,以及选择合适的个体化治疗。由于CTCs含量非常少并且缺乏有效的特异性标志物,有关CTCs的研究进展比较缓慢。现有的分离、检测技术和方法各有利弊,至今尚未有一个统一的实验方案和标准。 复制选择性溶肿瘤病毒是随着人们对肿瘤和病毒分子生物学研究的深入了解和分子生物学技术的发展,用基因工程方法改造野生型病毒或发现先天性嗜肿瘤的病毒株,这些病毒能选择性在肿瘤细胞中复制,而在正常细胞中不复制或复制很低。其中腺病毒载体因其具有多方面的优势,比如,感染细胞类型广、感染效率高、理化性质稳定、容易制备高滴度病毒、不整合入细胞基因组、遗传毒性较低、安全性好、既能感染分裂期也能感染非分裂期细胞等,被广泛应用于肿瘤基因治疗。 本课题正是利用复制选择性溶肿瘤腺病毒这种特有的对肿瘤细胞的选择性复制,并在此基础上对病毒结构加以改建,使其能够帮助我们在成千上万的血细胞中比较容易地发现恶性肿瘤细胞。 绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein,GFP)是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白。GFP本身是一种酸性、球状,可溶性天然荧光蛋白,其性质极其稳定,易耐受高温处理,甲醛固定和石蜡包埋都不影响其荧光特性。本课题已成功将该蛋白插入腺病毒基因组,并用这种改造过的腺病毒感染恶性肿瘤细胞。随着病毒在恶性肿瘤细胞中大量复制,GFP的表达随感染时间的延长而逐渐增强,在合适的时间通过荧光显微镜观察,可以比较方便地将极少量的恶性肿瘤细胞从大量的血细胞中找出来,是一种简便的、有效的检测消化系统CTCs的新方法。 材料和方法： 选取多株人消化系统恶性肿瘤细胞系,包括食管癌细胞系EC-1、胃癌细胞系AGS、结肠癌细胞系SW620、胰腺癌细胞系Suit-2,消化计数后加入健康人全血中,通过梯度时间、梯度病毒孵育后,经过DAPI染色,在荧光显微镜下计数产生绿色荧光的细胞,计算阳性率,观察荧光强度。本实验以未加肿瘤细胞的健康人全血为空白阴性对照,以裸肿瘤细胞为阳性对照。数据统计采用SPAA17.0统计软件处理。 结果： 1.本实验中采用的经过改建的溶肿瘤腺病毒不感染人白细胞,不在人白细胞中复制。 2.本实验中采用的经过改建的溶肿瘤腺病毒能够特异性感染恶性肿瘤细胞,并在其中大量复制,但是病毒量对肿瘤细胞GFP阳性表达率和表达强度有明显的影响;孵育时间也是一个很重要的影响因素,随着时间的延长,活细胞的阳性表达强度明显增强。但时间过长会导致活细胞数量明显减少。 3.在人食管癌细胞系EC-1、胃癌细胞系AGS、结肠癌细胞系SW620和胰腺癌细胞系Suit-2各组实验中,阳性率均数分别为76.6%、73.3%、76.6%和80.0%,采用统计学多分组二分类分析方法发现AD11病毒在检测CTCs中对各实验细胞系阳性表达率无明显统计学差异,说明对各实验细胞系敏感性无明显差异(X2=0.3739,p=0.946)。 结论： 本课题改建后的溶肿瘤腺病毒在人消化系统恶性肿瘤的临床前试验中显示出令人满意的标记恶性肿瘤细胞的效果,具有感染效率高、敏感性强、特异性强等特点,是一种简便的、有效的检测消化系统CTCs的新方法。
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