摘要
马铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分-蛋白酶(Helpercomponent-proteinase，HC-Pro)是一种多功能蛋白，参与病毒的蚜传、症状表达、基因组复制、移动、抑制RNA沉默，以及与其他属病毒的协生等过程。本文利用不同体系分析了烟草脉带花叶病毒(Tobaccoveinbandingmosaicvirus，TVBMV)和马铃薯A病毒(PotatovirusA，PVA)HC-Pro不同突变对RNA沉默抑制、协生活性和致病力的影响，明确马铃薯Y病毒属病毒HC-Pro调控这些过程的机制，为利用弱毒株系防治TVBMV提供物质基础和理论指导。本研究主要研究结果如下： 构建了包含pCaGFP、pCahpGFP和pCaHC(含有TVBMVHC-Pro基因)三个载体的RNA沉默抑制瞬时表达分析体系，并利用此体系比较了TVBMVHC-Pro野生型和18个突变体的抑制RNA沉默活性，这些突变体抑制RNA沉默的活性分为四类：(1)5个突变体抑制RNA沉默活性升高；(2)5个突变体抑制RNA沉默活性不变；(3)2个突变体抑制RNA沉默活性降低；(4)6个突变体丧失了抑制RNA沉默活性。用抑制RNA沉默活性强的突变体浸润本氏烟叶片中GFP蛋白的表达量更大，而用抑制RNA沉默活性丧失的突变体浸润的本氏烟叶片中检测不到GFP蛋白的表达。 利用pAGFP、pAhpGFP和pAHC(含有PVAHC-Pro基因)三个载体构成的瞬时农达体系研究了PVAHC-Pro突变对其抑制RNA沉默活性的影响。结果表明，9个突变休的抑制RNA沉默活性降低，另外9个突变体丧失了抑制RNA沉默活性。相同的突变对TVBMV和PVA两种病毒HC-Pro抑制RNA沉默活性的影响不同，如TVBMVHC-Pro突变体D198A抑制RNA沉默活性降低，而PVAHC-Pro相同突变体丧失了抑制RNA沉默活性。第6位保守氨基酸F缺失后，PVAHC-Pro抑制RNA沉默活性降低，面TVBMVHC-Pro抑制RNA沉默活性丧失。 携带野生型HC-Pro的马铃薯X病毒(PotatovirusX，PVX)侵染性克隆接种本氏烟后引起植株的系统坏死。利用PVX载体研究了TVBMV和PVAHC-Pro突变对协生作用的影响。TVBMVHC-Pro的6个突变体在本氏烟上不引起坏死症状，另外12个突变体与野生型HC-Pro一样在本氏烟上引起坏死症状。TVBMVHC-Pro丧失抑制RNA沉默活性的突变都同时丧失了协生作用，表明TVBMVHC-Pro这两种功能间具有相关性。PVAHC-Pro的11个突变体失去了协生功能，其中9个突变体丧失了抑制RNA沉默活性，2个突变体抑制RNA沉默活性降低。 利用携带GFP的TVBMV侵染性克隆pCaTVBMV-GFP测定了HC-Pro17个突变对TVBMV致病力的影响。野生型pCaTVBMV-GFP在本氏烟上能够引起脉明、花叶、畸形和植株矮化等症状，在紫外灯下表现出明显的绿色荧光。突变体EITC、AGS和SQN表现脉明及叶片畸形症状，与野生型TVBMV症状一致，说明这些位点的突变对病毒的致病力无影响。突变体PAK、D198Y、D198F和D198G在接种后第8天症状表现轻微的脉明，但后期症状与野生型病毒相似，说明这些位点的突变延迟了症状的产生。突变体APS、D198H、D198R、D198K、FINK、F6Del、D198A、DEN、IQI和ART接种的植株初期仅表现脉明症状。紫外灯下观察发现，症状明显的植株都表现出较明显的绿色荧光，而症状变轻的突变体中，D198R初期荧光强度与野生型病毒一致，其余突变体侵染植株均表现较微弱的绿色荧光。抑制RNA沉默丧失的6个突变体致病力都减弱，说明HC-Pro抑制RNA沉默活性与病毒致病力之间存在相关性。
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