摘要
WRKY转录因子是一类参与多种胁迫反应的诱导型转录因子，因其N-端含有由WRKYGQK组成的高度保守氨基酸序列而得名，它能够与(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)发生特异性作用，调节启动子中含W-box元件的调节基因和/或功能基因的表达，从而参与植物的各种防卫反应，调节植物的生长发育，植物代谢以及信号转导中的调控等。目前虽然对拟南芥、烟草及水稻中的WRKY基因研究较多，但迄今为止有关棉花WRKY转录因子的报道却很少。本实验拟在棉花中获得和抗旱和耐盐相关的WRKY基因，为棉花育种奠定基础。 本研究以棉花叶片作为实验材料，利用电子克隆和RT-PCR的方法克隆了陆地棉中三个新的WRKY因，即GhWRKY4、GhWRKY5和GhWRKY6，并对其进行了序列分析及表达特性分析。具体结果如下： 1.以NCBI上登录的拟南芥74条拟南芥WRKY因cDNA序列为种子序列，BLAST搜索棉花EST数据库。在此基础上，将部分重叠且高度同源的棉花EST序列进行拼接，以拼接的重叠群为种子序列重复进行搜索和拼接，直到重叠群不能继续延伸为止。利用ORFfinder软件进行开放阅读框分析，利用primer5.0设计特异引物进行PCR扩增，以陆地棉品种山农圣杂3号为材料，结果共有4对引物扩增出目的条带。测序分析发现其中一个为NCBI已经收录的GhWRKY2基因，另外三个为新的陆地棉WRKY基因，分别命名为GhWRKY4、GhWRKY5和GhWRKY6，并提交到GeneBank数据库中。GhWRKY4的GeneBank登录号为JQ081265，基因全长787bp，开放阅读框共758bp，编码252个氨基酸；GhWRKY5的GeneBank登录号为JQ081266，基因全长865bp，开放阅读框共522bp，编码173个氨基酸；GhWRKY6的GeneBank登录号为JQ081267，基因全长681bp，开放阅读框共552bp，编码183个氨基酸。 2.生物信息学分析发现这三个WRKY蛋白均含有一个WRKY结构域，锌指结构为C2H2型，因此它们都属于WRKY家族的第Ⅱ类。用Protparam预测这三个棉花WRKY蛋白的理化性质，结果表明这三个WRKY蛋白均为不稳定蛋白；用ProtCompVersion进行亚细胞定位发现这三个WRKY蛋白均位于细胞核内；用ProtScale对棉花WRKY氨基酸序列的疏水性/亲水性进行预测，结果发现这三个蛋白均为亲水性蛋白；用CBS的Protfun软件预测WRKY编码蛋白的功能，WRKY4蛋白具有转录、转录调控、生长因子功能；WRKY5蛋白具有转录功能；WRKY6蛋白具有转录、转录调控、免疫应答、生长因子功能。 3.运用RT-PCR分析在不同组织中的表达，结果表明这三个WRKY基因均在叶片中表达量最高。用250mmol/LNaCl和20%PEG6000模拟盐胁迫和干旱胁迫，分不同时间段来处理棉花幼苗，检测GhWRKY4、GhWRKY5和GhWRKY6的表达情况。通过实时荧光定量PCR分析盐胁迫和干旱胁迫下的基因表达，结果显示GhWRKY4受盐胁迫和干旱胁迫诱导后上调表达，而GhWRKY5仅受干旱胁迫的诱导表达，GhWRKY6则对这两种胁迫诱导反应都不是很明显。
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