摘要
共轭亚油酸(conjugatedlinoleicacid,CLA)是一类对人及动物具有多种生物学功能的多不饱和脂肪酸,在抗癌、防止动脉粥样硬化、减肥和调节机体功能等方面有一定的作用,可作为营养保健品和强化饲料添加剂等,是目前国内外研究机构比较关注的营养保健品。目前工业生产上主要采用碱异构法,但化学合成CLA产物中会出现多种其它异构体,而且有些对人体是有害的,难以满足人类的需求。自然界中的许多微生物都能够利用自身亚油酸异构酶将LA转化成CLA,与化学合成法生产CLA相比,所得产物中的活性CLA异构体的纯度较高,不会产出有害成分,条件非常温和,有利于产品的开发应用。细胞固定化技术是20世纪70年代开始兴起的一种新型的生物技术,利用细胞固定化技术可以实现细胞的高密度培养,且可在一次接种的情况下,进行连续发酵。研究利用固定化微生物细胞技术进行CLA的生物合成具有很大的潜力和价值。 本论文以本实验室筛选并经诱变获得的乳酸菌UV3-9为生产菌,以包埋固定化技术发酵生产CLA为基础进行了研究。首先,对固定化乳酸菌UV3-9的固定化条件进行了优化;其次,优化了固定化乳酸菌UV3-9发酵产CLA的发酵条件,并进行了批次发酵研究;随后研究了用缓冲液代替培养基直接转化LA为CLA,对其转化条件进行了优化,并进行了批次转化的研究;最后利用青霉素能改变细胞通透性的性质,研究青霉素在发酵过程中提高CLA产量的作用。研究结果如下: (1)乳酸菌UV3-9固定化所用材料最佳浓度分别为:SA2%、PVA7%、CaCl23%、H3BO36%。确定的最优化的固定化条件为:固定化小球直径2-3mm、菌细胞包埋量3%、过夜浸泡固定化处理。优化后CLA的最大产量达到35.478μg/mL。 (2)优化的固定化乳酸菌UV3-9的最佳发酵方式是:采用50mL三角瓶厌氧静置发酵,且发酵前对固定化乳酸菌UV3-9进行预培养。优化的发酵条件为:底物最适添加量为0.3%,发酵最适温度37℃,最适初始pH6.5,最适发酵时间28h。发酵条件优化后CLA产量由优化前的33.364μg/mL提高到89.986μg/mL,LA转化率由1.64%提高到4.43%,优化后的转化率是优化前的2.70倍。 固定化乳酸菌UV3-9可进行7个批次的发酵,CLA产量波动不大,产量均在80.476μg/mL以上,说明固定化菌体的酶活性比较稳定,但固定化乳酸菌小球粘黏在一起成块,不利于批次发酵的继续进行。利用3%CaCl2浸泡的方法可以提高批次发酵的批次数达到15批次,而且CLA产量在前9个批次比较稳定,产量均在80.300μg/mL以上,可见此处理方法对提高固定化乳酸菌小球发酵产CLA的使用批次是有效的。 (3)优化的固定化乳酸菌UV3-9直接转化LA生成CLA的最佳条件是:转化介质为0,05mol/L磷酸缓冲液(pH6.5),底物最适添加量为0.3%,最适转化温度39℃,最适初始pH6.5,最适转化时间28h。转化条件优化后CLA产量由优化前的103.881μg/mL提高到111.437μg/mL,LA转化率由5.13%提高到5.53%,优化后的转化率是优化前的1.71倍。与发酵相比,直接转化的方法所用缓冲液成分简单,转化过程中菌种的转化环境变化不大,更有利于转化的进行,而且成本低,转化液容易滤去,方便了批次转化的进行,CLA产量较发酵法提高了1.18倍。 固定化乳酸菌UV3-9进行了8个批次的连续转化,CLA产量波动不大,产量均在87.222μg/mL以上,说明固定化菌体的酶活性比较稳定。利用3%CaCl2浸泡的方法可以提高批次转化的批次数达到15批次,而且CLA产量在前10个批次比较稳定,产量均在81.269μg/mL以上,此方法对固定化乳酸菌小球直接转化底物LA产CLA是有效的。 (4)添加青霉素对CLA产量有一定的影响,在乳酸菌扩培、固定化乳酸菌活化、发酵三个时期同时添加青霉素溶液。研究结果显示:在三个实验阶段开始5h时添加青霉素最合适,最佳添加量为2mL(25μg/mL),青霉素的最佳添加方式是分两次进行添加,CLA的产量可达103.632μg/mL。
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