秸秆还田土壤中细菌群落结构多样性分析及纤维素降解细菌的分离

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中文摘要：本文采用传统的细菌分离培养方法和DGGE非培养方法对不同秸秆还田条件下的土壤细菌群落多样性进行了研究。从秸秆还田后的土壤中提取细菌的总基因组DNA，利用细菌通用引物F357GC/R518扩增16SrRNA基因的V3可变区，结合变性梯度凝胶电泳(DGGE，denaturinggradientgelelectrophoresis)技术分析样品细菌群落组成，以揭示秸秆土壤还田中细菌群落结构的多样性。采集小麦/玉米秸秆还田土壤样品，通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离纤维素降解细菌，通过16SrRNA基因序列的分析对分离的菌株进行初步鉴定。以未处理的玉米秸秆为碳源，研究了氮源、发酵时间、初始发酵温度、培养基初始pH等条件对伯克氏菌产纤维素酶条件的影响。多样性研究结果表明，不同秸秆还田后土壤之间细菌群落结构存在较大差异，DGGE图谱中特异性的11个条带的序列分析结果显示，其中10个条带代表的细菌是非培养细菌(Unculturedbacterium)，显示了DGGE技术的优越性，秸秆还田处理的土壤相对于对照组，细菌群落Shannon指数相对较高，细菌的多样性优于对照组，主成分分析也表明几种秸秆还田处理的土壤与对照组的土壤相比，细菌群落多样性特征存在一定的差异。对DGGE图谱中的主要条带序列分析结果显示，11条带分别归属于伯克氏菌属(Cupriavidussp.)，泉发菌属(Halophilicsp.)，不动杆菌属(gammaProteobacteriumsp.)，链球菌属(Streptococcussp.)，堆囊菌属(Sorangiumsp.)，δ-变形菌属(deltaProteobacteriumsp.)和酸杆菌目(Acidobacteriales)。采用CMC-Na[羧甲基纤维素钠，carboxymethylcellulose(CMC)-sodiumsalt]平板进行降解秸秆纤维素的细菌的筛选，分离得到45株细菌和3株放线菌，通过进一步的筛选，获得1株高活性纤维素降解细菌，初步鉴定其为一株伯克氏菌。筛选的纤维素降解细菌中，菌株XWS-12具有较强的纤维素酶活，该菌株产纤维素酶最适宜的氮源为硝酸钠，培养时间为60h，培养温度为37℃，培养基初始pH为4-5，该菌株的CMC酶活最高，可达25U/ml。粗酶液的最适反应温度为50℃，最适反应pH为5，在pH4-8的范围内酶活性较稳定。粗酶液的热稳定较差，不同温度条件下，酶活力的变化结果表明，当温度超过50℃，该酶活力显著下降，当温度为50℃，保温1h，酶活力损失53％。筛选的48株纤维素分解菌纯培养并经分子鉴定，结果显示其分别属于伯克氏菌属(Burkholderiasp.，10株)，类芽孢杆菌属(Paenibacillussp.，8株)，苍白杆菌属(Ochrobactrumsp.，5株)，芽孢杆菌属(Bacillussp.，2株)，土壤杆菌属(Sediminibacteriumsp.，2株)，链微菌属(Streptomycessp.，2株)，链霉菌属(Streptomycessp.，1株)，生丝微菌属(Devosiasp.，1株)，无色杆菌属(Achromobactersp.，1株)，固氮螺菌属(Azospirillumsp.，1株)，寡养单胞菌属(Stenotrophomonassp.，1株)，甲基杆菌属(Balneimonassp.，1株)，根瘤菌属(Rhizobiumsp.，7株)，根瘤菌科(Rhizobiaceae，am)，根瘤菌目(Rhizobiales，1株)和γ-变形菌纲(gammaproteobacteria，2株)。

作者：

陶少强

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关键词：

纤维素分解菌纤维素酶活力变性梯度凝胶电泳群落结构

授予学位：

硕士

学科专业：

微生物学

导师：

朱林

学位年度：

2012

学位授予单位：

安徽农业大学

语种：

中文

中图分类号：