摘要
青霉素酰化酶（亦称青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶）既可水解青霉素和扩环酸分别生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)，也能制备半合成抗生素类。对青霉素酰化酶高效固定化以提高其对温度、pH值、溶剂极性等方面的适用性和反复回用的稳定性，提高酶的催化效率，并易于产物的分离。目前固定化酶技术研究中对载体及连接方式考虑的较多，而对于酶存在的微观环境及载体的表面化学性质研究较少，以致于在酶固定过程及后期的催化过程中，酶蛋白的结构易于改变，且缺乏底物亲和性。优化改善青霉素酰化酶的固定化不仅在工业生产的连续化和自动化应用上有重要价值，而且在生物学的基本理论研究中，在临床医学和促进其他生化技术的发展中，都有重大的意义。 本论文将大分子拥挤试剂引入到青霉素酰化酶的固定化过程，研究了酶所存在的微环境对酶催化性能的影响;此外根据大分子拥挤效应对大分子拥挤试剂进行修饰，来调节修饰固定化酶的微环境，实现酶的高效固定，使酶的活性发挥到最佳、酶的稳定性得到改善;最后探讨了修饰固定化酶在非水相体系中的催化稳定性研究。实验结果归纳如下: 一、几种大分子试剂的引入，都能在一定程度上提高青霉素酰化酶的催化活力，且在加酶量为150mg/g(support)条件下，酶蛋白的负载率均在95％以上。当大分子试剂的含量为酶蛋白的7.5％左右时，其增强作用达到最大。BSA、Dex10k、Dex40k参与的仿生固定化酶中，青霉素酰化酶的活力为空白MCFs中活力的1.26倍以上，介孔中共价固定化酶的表观活力达到1067.1U/g（以湿重计）。 50℃条件下热处理1小时后游离酶活力基本完全丧失，处理6小时后介孔中的共价固定化酶保持了初始活力的32.0％，而BSA和Dex10k参与固定化的共价固定化青霉素酰化酶的活力仍分别保留了初始活力的53.0％和51.5％。 二、醛基化大分子试剂的引入，都能在一定程度上提高仿生固定化青霉素酰化酶的催化活力。醛基化BSA和Dex10k仿生固定化酶的活力分别为未醛基化BSA和Dex10k固定化酶的1.22和1.27倍。添加醛基化BSA的固定化酶催化最适温度与添加未醛基化BSA的固定化酶耐受温度的范围更宽。在最适pH方面，醛基化大分子修饰固定化酶从碱性偏移至中性。 三、水相/石油醚等形成的两相体系是适合固定化青霉素酰化酶催化水解的反应体系。适量的大分子修饰能辅助提高有机相中固定化酶的活力和连续使用稳定性，该两相体系中修饰固定化酶活力提高了59.4％。在石油醚等疏水有机溶剂中，有机相浓度高时对固定化酶热稳定性起保护作用，有机相浓度低时能提高固定化酶的操作稳定性。两相体系中，产物6-APA全部分布于水相，高浓度的产物通过简单分液即可分离，这为工业化生产半合成抗生素重要中间体6-APA提供了经济高效、环境友好的新途径。 醛基化修饰能稳定固定化酶的亚基，避免其在操作过程中脱落，能有效维系酶的刚性，提高了酶在极端环境如离子液体中的催化活力和热稳定性。醛基化BSA修饰的PA试样在疏水性离子液体C6minPF6中50℃热处理10h保持近80％的活力。
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