摘要
膀胱肿瘤是我国泌尿外科最常见的肿瘤，占全部恶性肿瘤的3.2％，对1988-2002年我国部分市、县膀胱癌发病率进行统计分析，结果显示1988-1992、1993-1997、1998-2002年膀胱癌发病率分别为8.22/10万、9.45/10万、9.68/10万，呈逐年上升趋势。在我国泌尿、男生殖系统肿瘤中，膀胱癌的发病率和病死率仍居首位。 目前膀胱肿瘤的诊断主要手段为膀胱镜检查和尿细胞学检查。其中膀胱镜检为有创检查，患者心理接受度低。尿细胞学检查的特点是敏感性略低，而特异性较高。在临床应用中应注意尿细胞学检查诊断膀胱癌的假阳性率为1％～12％，需结合其他检查明确诊断。荧光膀胱镜检查能发现普通膀胱镜难以发现的小肿瘤或原位癌，检出率可以提高14％～25％。荧光膀胱镜的缺点是诊断膀胱癌的特异性相对不高，炎症、近期膀胱肿瘤电切术和膀胱灌注治疗会导致假阳性结果。因此，在美国NCCN或AUA制定的《膀胱癌诊治指南》中荧光膀胱镜检查仍未纳入被推荐的常规检查项目。 目前尚没有一种理想的膀胱肿瘤标志物能够取代膀胱镜和尿细胞学检查。而OCT4可能成为膀胱肿瘤早期检测及治疗的靶目标之一。OCT4基因为POU转录因子家族中的一员，主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌肿，对维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。作为胚胎干细胞的特异性基因，主要表达于胚胎及生殖细胞肿瘤中,但在膀胱癌组织中同时检测到了OCT4的表达，其表达与肿瘤发生相关度为0.6(P＜0.001)，因此OCT4有可能成为膀胱肿瘤筛选的指标。同时，膀胱非肿瘤组织中也有低表达(P＜0.001)，这种表达可以解释为肿瘤在发生过程中胚胎基因的激活或干细胞致癌的一种证据。 OCT4自1990年发现自今，OCT4基因结构、亚型、OCT4蛋白结构及其功能已经基本明确，其基因调节通路仍欠明确。由于OCT4主要表达于胚胎及生殖细胞肿瘤中，多数研究针对上述肿瘤，并且已经证实OCT4为人生殖肿瘤干细胞标志物、人干细胞标志物。国内外有研究证实膀胱癌组织中有OCT4的表达，多数认为其表达差异性与病理分级、浸润程度有相关性，与临床分期、年龄等无相关性，但在是否于膀胱癌转移有相关性上存有异议。同时对于膀胱癌细胞株的研究较为欠缺。 本实验将从膀胱癌肿瘤组织标本及5株膀胱癌细胞株两个层面进行研究，通过免疫组化、WesternBlot和反转录聚合酶链式反应(PCR)技术检测OCT4在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株中的表达。进一步明确OCT4与膀胱癌生物学行为的相关性，探讨OCT4能否作为膀胱癌肿瘤标记物。 目的:采用蛋白印迹技术(WesternBlotting)、反转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)检测OCT4在膀胱尿路上皮癌细胞株RT-4，Tcc-Sup，KK47，T24，5637及人膀胱上皮永生化细胞株SV-HUC-1中的表达，为研究OCT4在膀胱癌发生中的作用及可能机制打下基础。同时采用免疫组化技术，检测转录因子OCT4在膀胱癌及膀胱正常组织是否表达及其表达水平的差异性，分析其与分化程度、临床分期、复发、预后等的相关性，探讨其能否可作为膀胱癌早期诊断的标志物。 方法: 一:选取5株不同病理分级的膀胱尿路上皮癌细胞株RT-4(T2，G1)Tcc-Sup(T4,G2),KK47(T3,G2)T24(T4,G3)5637(T4,G3)及人膀胱上皮永生化细胞株SV-HUC-1作为实验对象。细胞培养后收集细胞，提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量检测，用Westernblot方法检测蛋白质样品中干细胞标志物OCT4的表达情况，使用化学发光法，以等量的β-actin蛋白质作对照，分析表达差异性。提取RNA后使用试剂盒进行RT-PCR，读取吸光度，制作溶解曲线，以目的基因与GAPDH的比值进行定量分析。 二:为检测OCT4在膀胱癌中的表达，我们共收集46例完整切除的膀胱癌组织及10例正常膀胱粘膜组织标本。所有膀胱癌标本均经过最后的病理诊断证实，并按照世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)制定的分级标准进行病理分级。患者年龄为1岁10个月-86岁，平均年龄为58岁，男性40例，女性6例;其中移行细胞癌41例，胚胎横纹肌肉瘤5例;低分化G116例，中高分化G2-G330例;Ta-T2期13例，T2-T4期33例;无转移24例，血管淋巴转移22例，随访时间1.9±0.2年。采用免疫组化方法，检测OCT4在各膀胱癌组织中的表达。采用Image-proplurs图像分析软件进行染色结果分析。测定条件:每张切片随机观察5个高倍视野（放大400倍）计算均值，阳性结果判断根据平均每高倍视野阳性癌细胞数占所观察癌细胞总数的百分率。以阳性细胞数＜5％为（-），5％～25％为(+)，26％～50％为(++)，＞50％为（+++）区分染色强度。最后随机摄取5个高倍视野照相（放大400倍），由图象分析软件检测该总视野内阳性反应细胞的总面积和积分光密度(IOD)做半定量分析。平均光密度(AOD)=积分光密度(IOD)/总面积(areasum)。 统计学分析:应用SPSS17.0统计软件包进行分析，计量资料以均数±标准差表示，OCT4相对表达量的比较时先剔除SV-HUC-1组，其余组比较采用单向方差分析(One-WayANOVA)，方差不齐采用Welch法，两两比较采用Dunnett'sT3法，其余各组与SV-HUC-1组的比较采用单样本t检验，并将检验水准调整为0.01;计数资料比较选用Pearsonx2检验;累积生存率的计算采用Kaplan-Meier法，两组生存时间的比较采用Log-rank检验;P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果: 2.1OCT4在人类膀胱癌细胞株及SV-HUC-1细胞株中的表达 RT-PCR检测发现SV-HUC-1细胞不表达OCT4RNA;膀胱癌细胞株RT-4，Tcc-Sup，KK47，T24，5637中均表达OCT4RNA，但是各种细胞株的表达程度有所不同;通过Western-Blot分析上述6种细胞中OCT4的表达，肿瘤细胞株均表达，但是在SV-HUC-1细胞中未发现OCT4蛋白的存在。 2.2OCT4在膀胱癌组织及正常组织中的表达 结果显示其特异性染色定位于肿瘤细胞核内;本实验中使用的46例膀胱癌组织中，OCT4阳性为35例，占总例数的76.1％，在正常膀胱组织中未能检测出OCT4的表达。膀胱癌组织OCT4蛋白阳性表达率显著高于正常组织(x2=20.290，P＜0.001)。 2.3OCT4蛋白的表达与膀胱癌临床病理因素的关系 OCT4蛋白的表达情况与肿瘤分化程度相关，低分化组共16例，阳性为9例，阳性率为56.3％，中高分化组共30例，阳性为2例，阳性率为6.7％，低分化组阳性率显著高于中高分化组(x2=14.100，P＜0.001);与肿瘤转移相关，血管淋巴转移组14例，阳性9例，阳性率为37.5％，无转移组22例，阳性2例，阳性率为9.1％，两组阳性率有显著差异(x2=5.091，P=0.024);但与膀胱癌的浸润深度无相关性(x2=14.100，P=0.494);与性别亦无相关性(x2=0.199，P=0.655)。 2.4OCT4蛋白的表达与膀胱癌患者预后的关系 本实验对象的平均随访时间为25个月，中位无转移时间为30个月，患者膀胱癌根治术后的1年和3年的累积无转移率分别为76.8％和34.5％。分析发现，OCT4阳性患者组平均无转移时间为22个月，3年累积无转移率为0.0％，明显低于OCT4阴性组的31个月和81.8％，有统计学差异(x2=10.113，P=0.001)。 结论: 1.OCT4在尿路上皮癌细胞株中mRNA及蛋白水平均有表达，人膀胱上皮永生化细胞株中mRXA及蛋白水平均无表达，有可能成为治疗的新靶点。 2.OCT4蛋白在膀胱癌组织中的表达率要高于正常膀胱组织，其表达量与肿瘤病理分级、复发、预后有密切相关性。本实验为肿瘤干细胞在膀胱癌发生及复发的研究中提供一定的依据，同时提示OCT4有望成为早期检测膀胱癌及评估患者预后的一个分子生物学指标。
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