摘要
目的：在中医“肺脾相关”理论指导下，以“肺痹”为切入点，分析、总结类风湿关节炎（RA）肺功能损伤的中医学病机，从动物实验角度系统观察佐剂关节炎(AA)大鼠足跖肿胀度、关节炎指数(AI)动态变化和肺功能变化特点，检测AA大鼠滑膜、肺组织TGF-β1/Smads、ERK信号通路及细胞因子变化，评价中药新风胶囊(XFC)对其影响，探讨XFC改善AA大鼠肺功能的作用机制。 方法： 1.理论研究系统搜集和整理RA肺病变相关文献，筛选和总结引起RA肺病变发病机制的国内外研究现状，评价和分析转化生长因子β1(TGF-β1)诱导Smads、ERK通路激活途径，从理论角度研究RA肺功能降低与TGF-β1/Smads、ERK信号通路cross-talk的关系。依从中医基础理论阐述中医“肺”与“脾”之间关系，从生理病理及病因病机角度探讨“肺脾”的联系，探寻健脾化湿通络法治疗RA肺功能降低的机制。 2.实验研究将大鼠随机分为正常对照(NC)组，模型对照(MC)组，甲氨喋呤(MTX)组，雷公藤多苷片(TPT)组和XFC组，每组10只。除NC组外，其余大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(CFA)0.1ml致炎造模，第15d在尾根部注射CFA0.05 ml加强免疫，第19d给药。各组的给药量如下:XFC组0.034g/1ml/100g，TPT组0.57mg/1ml/100g，MTX组0.095mg/1ml/100g，NC、MC组予生理盐水9mg/1ml/100g; XFC、TPT、NC、MC组一天一次，MTX组一周一次，各组连续用药30 d。观察各组大鼠体质量、足跖肿胀度、关节炎指数（AI）和肺功能变化，光镜、电镜观察滑膜、肺组织形态学变化，酶联免疫吸附法检测细胞因子TGF-β1、白介素(IL)-1β、IL-4、IL-10、γ干扰素（IFN-γ）、结缔组织生长因子(CTGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)表达，PCR、免疫组化、免疫印迹法检测滑膜、肺组织Smads/ERK通路的变化。 结果： 1.理论研究结果 1.1 TGF-β1/Smads通路的激活促使RA肺功能降低:TGF-β1首先与其受体TβRⅡ、TβRⅠ结合形成三聚体复合物，进一步磷酸化Smad2/3，p-Smad2/3与TβRⅠ受体分离，即与Smad4结合形成复合体，携带信号从胞浆进入胞核激活转录，促进肺病变;而Smads7是抑制分子，Smad7抑制能力降低，不能抑制Smads信号的转录，失去对RA肺部病变的抑制作用，导致肺功能降低。 1.2 ERK信号通路诱导RA肺功能降低:ERK通路激活后可介导细胞生长、分化、增殖，促进成纤维细胞分泌和细胞外基质(ECM)在肺间质和肺泡中过度积聚，使得肺泡距离增加形成间质肺，肺毛细血管床和血流量的减少，血液流变学改变，出现肺弥散功能降低，氧和二氧化碳的交换作用减弱，同时ERK通路激活能调节炎症相关基因表达增加，导致肺功能降低。 1.3 Smads和ERK通路cross-talk是RA肺功能下降的重要因素:TGF-β1/Smad信号通路的激活过程也受ERK通路的调控，Smad2/3含有ERK磷酸化的位点，可被ERK磷酸化，促进p-Smad2/3与Smad4的结合并转录。同时，ERK通路受Smads通路调控，Smad4可调控ERK通路相关细胞因子或激酶的转录，从而激活ERK信号传导通路，Smads和ERK通路cross-talk共同导致肺功能降低。 1.4“脾虚”是RA肺功能降低的发病基础:脾虚致气血亏虚，脾土不能生养肺金，日久导致肺气失养，肺宣肃功能失调，出现咳嗽、自汗、气短等;脾虚运化功能失常，水液停滞，湿停中焦，痰湿内生，聚而生痰成饮，上干于肺，肺失治节，可见痰多，胸满憋闷，喉中痰鸣有声、胸背痛，迁延不愈，甚而喘促;脾虚致痰瘀互结，肺络阻滞，多见肺纹理紊乱、结节、间质纤维增生等。 1.5“健脾化湿通络法”能改善RA肺功能水平:根据RA肺功能降低的中医病机呈现“脾胃虚弱、气血不足、湿浊内生、痰瘀互结”和“虚实夹杂”的特点，临床上拟用“扶正祛邪”治则，采用“健脾化湿通络”治法，应用XFC治疗RA及肺功能损伤，取得了良好效果，XFC通过改善关节和全身症状体征，从而进一步改善肺部症状体征，提高弥散功能和通气功能。 2.实验研究结果 2.1 AA大鼠肺功能变化及XFC对其影响与NC组比较，MC组大鼠肺功能FEV1、FEF50、FEF75、MMF、PEF降低(P＜0.01)。 与MC组比较，XFC组FEV1、FEF50、FEF75、MMF、PEF升高（P＜0.05或P＜0.01）。 与MTX组比较，XFC组FEF50、FEF75、MMF升高(P＜0.05);与TPT组比较，XFC组肺功能参数FEF75、MMF升高（P＜0.05或P＜0.01）。 2.2 AA大鼠足趾肿胀度、AI、体质量变化及XFC对其影响相关分析显示:AA大鼠肺功能FEF75与足跖肿胀度呈负相关，FEF50、FEF75与AI呈负相关（P＜0.01或P＜0.05）。 给药前1d，与NC组相比，MC组大鼠体质量降低，足跖肿胀度、AI显著升高(P＜0.01)。 给药后30 d，与NC组比较，MC组大鼠足趾肿胀度、AI升高;与MC组比较，各治疗组大鼠足跖肿胀度、AI降低;与MTX组比较，XFC组足趾肿胀度差值降低（P＜0.01或P＜0.05）。 2.3 AA大鼠关节形态学变化及XFC对其影响光镜观察:与NC组比较，MC组大鼠滑膜及其附属组织可见大量炎性细胞浸润，血管增多，滑膜分层增多，呈绒毛状突起嵌入关节腔内，关节软骨表面剥脱或缺如。电镜观察:MC组滑膜细胞变形，线粒体肿胀，粗面内质网减少、破坏，核膜不完整，染色质分布不均，嵴突排列不规整或部分消失; XFC治疗后，大鼠滑膜可见少量中性粒细胞等炎细胞浸润，部分滑膜嵌入关节腔内，关节面较规整;滑膜细胞线粒体少量变形、肿胀，核膜边界较清楚，染色质较均匀，大部分嵴突排列完整。与MTX组比较，XFC组滑膜细胞线粒体肿胀减轻;XFC组TPT组比较无明显差异。 2.4 AA大鼠肺组织形态学变化及XFC对其影响光镜观察显示:与NC组比较，MC组大鼠肺泡结构不规整，肺泡腔萎缩或消失，部分呈肺实质性改变，肺间隔增宽，间质中可见大量炎细胞浸润，肺泡上皮细胞增生;电镜观察Ⅱ型肺泡上皮细胞数量减少，胞膜结构不完整，线粒体肿胀、变性，板层小体减少呈排空状态，肺间质内成纤维细胞增生。 XFC治疗组大鼠肺泡结构较规整，部分肺泡腔萎缩、变形，间质中可见少量中性粒细胞等炎细胞浸润;Ⅱ型肺泡上皮细胞结构基本完整，粗面内质网较丰富，线粒体大部分完好，偶见板层小体排空现象;与MTX组比较，XFC组肺组织炎细胞浸润和肺泡上皮细胞减少;与TPT组比较无显著差异。 2.5 AA大鼠血清细胞因子的变化及XFC对其影响相关分析显示:AA大鼠肺功能FEV1、FEF75与IL-1β、IL-4呈负相关，FEF25、FEF50、FEF75、MMF与TGF-β1、CTGF、FGF呈负相关;PEF与IL-10呈正相关，FEV1、FEF50与Th1/Th2呈正相关，FEF50、FEF75与IFN-γ呈正相关（P＜0.01或P＜0.05）。 与NC组比较，MC组血清细胞因子IL-1β、IL-4、TGF-β1、CTGF升高，IFN-γ、IL-10、Th1/Th2细胞、FGF降低（P＜0.01或P＜0.05）。 与MC组比较，XFC组IL-1β、IL-4、TGF-β1、CTGF降低，IFN-γ、IL-10、Th1/Th2、FGF表达升高（P＜0.01或P＜0.05）。 与MTX组比较，XFC组CTGF降低IFN-γ、IL-10、Th1/Th2表达量升高（P＜0.05）;与TPT组比较，XFC组TGF-β1降低（P＜0.05）。 2.6 AA大鼠滑膜、肺组织Smads通路变化及XFC对其影响相关分析显示:AA大鼠肺功能FEV1与TGF-β1 mRNA、蛋白呈负相关，FEF25与Smad4蛋白呈负相关，FEF50与TβRⅡ蛋白表达呈负相关，FEF75与TGF-β1、Smad3 mRNA、p-Smad2/3蛋白呈负相关，PEF与TGF-β1蛋白呈负相关（P＜0.05）;FEF50、MMF与Smad7 mRNA呈正相关(P＜0.05)。 与NC组比较，MC组大鼠滑膜、肺组织TGF-β1、Smad2/3/4 mRNA和TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4蛋白表达升高，Smad7mRNA、蛋白表达降低（P＜0.01或P＜0.05）。 与MC组比较，XFC组大鼠滑膜、肺组织Smad2、Smad3、Smad4 mRNA和TGF-β1、TβRI、TβRⅡ、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达降低， Smad7mRNA、蛋白表达升高（P＜0.01或P＜0.05）。 与MTX组比较，XFC组滑膜、肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA和TGF-β1、Smad2/3蛋白表达降低，肺Smad4 mRNA、TβRⅠ蛋白降低，滑膜、肺组织Smad7 mRNA升高(P＜0.05);与TPT组比较，XFC组滑膜Smad3 mRNA和TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4蛋白降低，Smad7蛋白升高（P＜0.05），肺组织p-Smad2/3降低，Smad7 mRNA升高（P＜0.05）。 2.7 AA大鼠滑膜、肺组织ERK1/2变化及XFC对其影响相关分析显示:AA大鼠肺功能FEV1与ERK2 mRNA呈负相关，FEF25与p-ERK1/2蛋白呈负相关，FEF75、MMF分别与ERK1/2、p-ERK1/2蛋白呈负相关(P＜0.05)。肺组织ERK1mRNA与Smad3 mRNA、TβRⅡ蛋白呈正相关，ERK2 mRNA与p-Smad2/3呈正相关，ERK1/2蛋白与Smad2mRNA、Smad4蛋白呈正相关，p-ERK1/2蛋白与Smad4 mRNA、p-Smad2/3蛋白呈正相关(P＜0.05);p-ERK1/2蛋白与Smad7蛋白呈负相关(P＜0.05)。 与NC组比较，MC组大鼠滑膜组织ERK2 mRNA、p-ERK1/2蛋白表达升高，肺组织ERK1、ERK2 mRNA、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达升高（P＜0.01或P＜0.05）。 与MC组比较，XFC组大鼠滑膜组织ERK2 mRNA、p-ERK1/2蛋白表达降低，肺组织ERK1、ERK2 mRNA、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白降低（P＜0.01或P＜0.05）。 与MTX组比较，XFC组肺组织ERK1、ERK2 mRNA表达降低(P＜0.05)。 结论： 1.AA大鼠肺功能的变化 1.1 AA大鼠肺功能损伤特点:AA大鼠存在肺功能损伤，肺功能变化以参数FEV1、MMF、PEF、FEF50、FEF75降低为主，主要表现特征为通气功能障碍，并伴有一定程度的小气道功能损伤。 1.2 Smads和ERK通路cross-talk导致肺功能降低:Smads和ERK通路在启动子TGF-β1诱导下，逐渐被磷酸化激活，进而进入细胞核参与转录活动，导致AA肺部病变发生，出现肺功能降低。 1.3 RA肺功能降低中医病机呈“脾虚湿盛”特征:“脾虚”在RA肺功能损伤发生、发展中起重要作用，脾气亏虚，正气不足，肺气虚弱;脾气亏虚，痰湿内生，肺失治节;脾气亏虚，痰瘀互结，肺络阻滞。 2.“健脾化湿通络”中药XFC对AA大鼠的疗效 2.1 XFC能明显抑制AA大鼠关节炎症反应:XFC能降低AA大鼠足趾肿胀度和AI，减少炎细胞对关节滑膜的浸润，减轻局部充血和肿胀，抑制血管翳的形成，改善关节功能。 2.2 XFC能明显改善AA大鼠肺功能水平:XFC通过提高肺功能参数FEV1、FEF50、FEF75、MMF、PEF表达，改善AA大鼠肺部通气功能和小气道功能，增强肺部气体交换率，提高肺功能水平。 2.3 XFC能明显提高AA大鼠体质量:XFC通过健脾益气、化湿通络的功效，能明显提高AA大鼠食欲及饮水量，增加体质量水平，改善全身症状和机能活动。 2.4 XFC能明显调节AA大鼠肺组织形态学:XFC能减轻炎性细胞浸润程度，通过抑制炎性介质对肺组织的刺激，降低AA大鼠肺间质纤维化程度，维持Ⅱ型肺泡细胞细胞器的功能和形态。 3. XFC改善AA大鼠肺功能的机制 3.1 XFC可降低AA大鼠关节炎症反应提高肺功能:XFC通过抑制滑膜组织炎细胞浸润，降低全身炎症反应，减少炎症介质渗出及对肺组织器官的刺激，抑制肺间质病变的发生，改善肺功能水平。 3.2 XFC可减轻AA大鼠肺部炎症反应提高肺功能:XFC通过抗炎作用，减少炎性介质对肺泡的直接刺激，促进中性粒细胞等炎细胞的吸收或清除，降低肺组织炎症反应，改善肺功能水平。 3.3 XFC可调节AA大鼠细胞因子平衡提高肺功能:XFC通过上调IL-10、IFN-γ、FGF表达，下调IL-1β、IL-4、TGF-β1、CTGF表达，抑制AA大鼠肺间质纤维化的发生，提高肺功能水平。 3.4 XFC可改善AA大鼠肺组织形态学提高肺功能:XFC通过减少炎性渗出物对肺组织损伤，保持肺组织病理形态学，维持肺泡Ⅱ型上皮细胞结构，增加肺泡的通气功能和弥散功能，改善肺功能。 3.5 XFC可调节AA大鼠TGF-β1/Smads通路提高肺功能:XFC通过提高Smad7表达，抑制p-Smad2/3与Smad4的结合及阻止Smad2/3磷酸化，延缓AA大鼠肺纤维化的发生，改善肺功能。 3.6 XFC可抑制AA大鼠ERK1/2通路表达提高肺功能:XFC通过抑制ERK1/2磷酸化过程，阻止信号通路的激活，减少致纤维化因子对肺组织的损伤，降低AA大鼠肺病变程度，改善肺功能。 3.7 XFC可调节AA大鼠Smads和ERK通路cross-talk提高肺功能:XFC通过调节信号通路cross-talk，降低信号传导与DNA的转录活动，抑制AA大鼠肺间质纤维化形成，改善肺功能。
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