家蚕30K蛋白基因的克隆表达及其抗凋亡功能研究

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中文摘要：家蚕30K载脂蛋白是家蚕幼虫血淋巴中主要的一群低密度脂蛋白，除载脂功能，还具有较强的抑制昆虫和哺乳动物细胞凋亡的活性。体内高血脂和自由基的堆积均可导致血管内皮细胞的凋亡，从而引起其功能发生异常。血管内皮细胞凋亡在动脉粥样硬化形成过程中具有至关重要的作用。由于家蚕30K蛋白兼具载脂功能和抗细胞凋亡的活性，推测其可能具有抑制人血管内皮细胞的凋亡从而保护血管内皮细胞的功能。因此，研究家蚕30K蛋白在血管内皮细胞凋亡过程中的作用极可能具有重要意义，进而可通过探索其药用价值，为防治和治疗动脉粥样硬化疾病提供新途径、新基础。家蚕30K蛋白基因在进化过程中产生很多种基因，编码的蛋白均具有相似的结构。本研究在前人研究的基础上，利用生物信息学工具，根据已报道的具有抗细胞凋亡功能的家蚕30K蛋白基因BmLp-c6（GenBank登录号:X54735）编码的氨基酸序列，与NCBI数据库进行同源性比对分析，获得两个与BmLp-c6同源性较高的家蚕30K蛋白其基因序列分别为BmLip-19G1(GenBank登录号:AY568957)和BmLp-C12p(GenBank登录号:NM_001101728)。然后利用RT-PCR技术从家蚕蛹中克隆了上述三条家蚕30K蛋白基因，并在家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中进行大量融合表达、纯化。表达产物纯化后经SDS-PAGE可检测到纯度较高的、分子量大小约为30kD的目的蛋白条带。Western blotting分析结果显示3种目的蛋白与融合表达标签6×His-tag单克隆抗体具有良好的特异性反应。利用自建的H2O2诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的体外损伤及凋亡模型，研究家蚕30K蛋白对H2O2诱导的HUVEC凋亡的保护作用。MTT法检测结果显示:3种30K蛋白均可一定程度上增强HUVEC细胞的活力。对胞内8-异前列腺素F2a（8-Isoprostane）（氧化应激标志物）浓度检测结果显示:利用H2O2处理HUVEC，可明显增加胞内8-isoprostane的浓度，而3种30K蛋白均可显著降低胞内8-isoprostane的浓度，表明3种30K蛋白均可通过降低细胞内的氧化应激程度从而保护HUVEC。DNA片段化ELISA检测结果显示:3种30K蛋白均可降低HUVEC胞内DNA片段化程度，表明3种30K蛋白对H2O2诱导的HUVEC细胞的凋亡均具有一定的抑制作用。流式细胞仪细胞凋亡检测结果也显示:3种30K蛋白均具有不同程度的降低HUVEC凋亡率的作用。综上所述，3种家蚕30K蛋白均可通过抑制H2O2诱导的细胞凋亡从而保护血管内皮细胞，本研究工作为今后进一步探索家蚕30K蛋白的药用价值奠定了基础。

作者：

陆青玲

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关键词：

家蚕 30K蛋白 Bac-to-Ba杆状病毒表达系统人脐静脉内皮细胞细胞凋亡

授予学位：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

于威、姚玉华、张耀洲

学位年度：

2011

学位授予单位：

浙江理工大学

语种：

中文

中图分类号：