摘要
在中枢神经系统中，星形胶质细胞主要对神经元起支持作用。当中枢神经系统发生损伤，如外伤、局部缺血和缺氧等，星形胶质细胞会由静息态进入活化态，即发生星形化，从而参与突触形成和神经可塑性的调节。在急性损伤期，活化的星形胶质细胞发挥着重要的作用，它不但能够提供营养因子，促进神经再生，还能将损伤区与正常组织进行隔离，防止损伤面积的扩大。但是，当损伤进入慢性期，以活化星形胶质细胞等为主要成分的胶质瘢痕会成为神经再生的机械性屏障，不利于神经损伤的修复。因此，星形胶质细胞活化的具体机制成为神经损伤修复治疗中的一个关键内容。 肝素，是星形胶质细胞发生活化时分泌量出现增长的细胞外基质之一，本研究利用肝素的这一性质，将其作用于大鼠原代星形胶质细胞，从形态、增殖和迁移的角度证实肝素诱导星形胶质细胞活化的性质，制备能够模拟体内活化且程度可控的体外模型，并进一步探究诱导星形胶质细胞发生活化的内在分子机制，为神经损伤治疗的有效进行提供实验依据。本文的主要内容如下: 1、原代星形胶质细胞的培养及纯化。以经典的McCarthy法为基础，取新生大鼠的大脑皮层，消化后得到星形胶质细胞悬液，培养10天后通过摇床过夜振摇的方法去除生长在星形胶质细胞上层的少突胶质细胞和小胶质细胞。为了提高星形胶质细胞的纯度，我们在接种细胞时采取差速黏附的方法减少成纤维细胞的污染，经过免疫荧光染色鉴定，培养细胞的GFAP阳性率从80％上升至95％以上，满足了后续实验对细胞纯度的要求。 2、肝素对星形胶质细胞活化作用的研究。首先，通过伊红染色和GFAP免疫荧光染色的方法检测星形胶质细胞的形态变化。结果显示肝素联合FGF-2以剂量依赖的方式促进细胞骨架发生重组，细胞由多角形的静息态向星形的活化态转变;随后的WesternBlotting结果显示，肝素可以提高星形胶质细胞中GFAP的表达量，进而证实肝素联合FGF-2能够诱导星形胶质细胞发生活化。然后，通过BrdU掺入法和流式细胞术检测星形胶质细胞的增殖情况，结果显示肝素联合FGF-2以剂量依赖的方式增加发生DNA复制的细胞比例，而且能够促进细胞由G1期向S期的转变，提高细胞的增殖率。最后，通过Transwell小室法检测星形胶质细胞的迁移情况，结果显示肝素联合FGF-2提高了星形胶质细胞的迁移能力。 3、星形胶质细胞活化的机制研究。通过抑制剂筛选、WesternBlotting和PCR等方法检测参与调控星形胶质细胞活化的信号通路，结果显示MAPK中的ERK和PI3K/Akt信号通路以及细胞膜上的N-钙粘素参与了肝素对星形胶质细胞活化作用的调控，并且这种作用与ROCK通路有一定的相关性。
NETL