摘要
在新生儿重症监护病房中患有呼吸系统疾病患儿经常需要高浓度氧治疗。高氧的应用虽然挽救了大量新生儿的生命，但同时也导致了高氧相关性肺损伤，严重者可能发展成为以肺泡发育延迟、异形毛细血管发育及不同程度的肺纤维化为特征的慢性肺部疾病-支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)。长时间吸入高浓度氧已被认为是BPD发生的最主要高危因素。随着超低及极低出生体重儿存活率增加，BPD的发生率在早产儿中的发病率也逐年增加，并成为威胁早产儿健康及生命的主要疾病。目前有关BPD的具体发病机制尚未完全阐明。因此，探索高氧致BPD的发生机制已成为国内外研究热点。 以往研究发现，BPD晚期肺纤维化的发生可能与炎症因子释放、氧化应激反应等相关，对于BPD早期肺水肿发生机制研究甚少，且早期给予抗炎及抗氧化治疗尚未取得确切疗效。因此，本研究尝试以探索BPD早期肺水肿形成机制为切入点。然而，我们课题组前期已发现，BPD早期肺水肿发生可能与肺上皮钠水转运障碍及紧密连接结构及功能破坏相关，那么在早期肺水肿阶段肺血管通透性变化规律及内皮细胞结构改变如何呢？目前尚不清楚。 间隙连接蛋白(Connexin，Cx)通过形成细胞间连接通道允许信号小分子及离子等在不进入细胞外间隙的情况下进行交换。Cx40是表达于血管内皮较广泛的一种Cx，目前多项研究表明，Cx40可能参与肺损伤及纤维化发生过程，同时在急性肺损伤时可能参与调控血管内皮通透性。 本实验以高氧致新生鼠肺水肿模型为研究对象，采用肺损伤评分、肺组织伊文氏兰渗出量检测、透射电镜、免疫组化、Western blot、RT-PCR技术对肺血管内皮细胞通透性改变及其超微结构变化进行探索，同时观察Cx40的表达变化，近而探讨Cx40在BPD早期肺水肿阶段可能发生的作用。 实验材料及方法 一、动物模型制备 健康受孕Wistar大鼠（由中国医科大学附属盛京医院实验动物部提供）自然分娩的新生鼠依据吸入氧浓度，随机分为实验组及对照组各48只，雌雄不限，实验组高氧模型制备参考我们以往文献，实验组Wistar大鼠（代母鼠喂养）生后即置于氧箱中，持续输入氧气，维持氧箱O2浓度为0.90(测氧仪监测)，CO2浓度＜0.5％（钠石灰吸收CO2），温度25～25℃，湿度50％～70％（变色硅胶吸收水分），每24 h定时开箱0.5h，添加水、饲料及更换垫料，并与对照组交换母鼠以避免因氧中毒致喂养能力下降。对照组FiO2为0.21（空气），实验控制因素同实验组。 二、标本采集和处理 每组分别于实验后1、3、5、7d随机选取12只，5％哥拉腹腔注射(0.6ml/100g)麻醉后，分离气管，打开胸腔，暴露心肺，剪开左心耳，经右室插入套管针至肺动脉，缓慢应用PBS缓冲液冲洗肺内残血，直至左心耳处流出无色液体，收集肺组织，左肺置于4％多聚甲醛中固定，用于免疫组化检测，右肺置于Eppendorf管中，液氮速冻，-80℃冰箱保存，用于Western blot及RT-PCR检测。 三、实验方法和观察指标 1、肺组织形态学观察。 2、肺血管伊文氏兰渗出量检测。 3、透射电镜观察肺血管内皮细胞超微结构变化。 4、免疫组化及Western blot方法检测Cx40在肺组织中的蛋白表达情况。 5、RT-PCR检测肺组织Cx40mRNA表达水平。 四、统计学分析 应用SPSS18.0进行统计学分析，所有数据均以(x)±SD表示，相同时间点组间差异比较采用T检验，组内差异显著性比较采用单因素方差分析及Bonferroni test。P＜0.05认为差异有显著性。 结果： 一、肺形态学观察 1d时，正常足月新生鼠肺组织肺泡样结构不规则，间隔数量较少，模型组肺形态较正常无明显差别;3d时，对照组可见肺间隔变薄，肺泡数量增多，然而在模型组可见间隔增厚，血管充血，间质可见中性粒细胞浸润;5d时，对照组肺泡数量增多，间隔继续变薄，而模型组5d时，肺组织评估可见中性粒细胞间质浸润增多，间质水肿加重，可见少量炎性细胞浸润到肺泡腔中。在正常新生鼠7d时，肺泡发育呈均匀一致分布，而模型7d时肺损伤程度较3d及5d均加重。肺损伤评分结果与观察结果相一致。 二、肺血管通透性检测 根据不同浓度EB的光密度值制作的标准曲线得出公式为:Y=200x+0.00547（x为伊文氏兰量％，Y为OD值），计算肺组织中染料含量结果示，肺组织中伊文氏兰含量随高氧暴露时间逐渐增高，于第5d时最高，高氧5d时肺组织中伊文氏兰含量较空气组5d及高氧组内其他时间点均有显著性差异(P＜0.05)。 三、肺血管内皮超微结构改变 对照组各时间点内皮细胞核清晰可见，呈不规则形，胞质内细胞器结构完整，细胞间可见完整紧密连接结构。随高氧暴露时间延长，内皮细胞逐渐出现肿胀、线粒体肿胀、吞噬小泡增多。在高氧5天时，紧密连接处可见较宽缝隙，高氧7天时紧密连接处可见间断的缝隙增宽，高氧1天及3天时紧密连接结构未见特殊改变。 四、肺组织中Cx40表达定位 Cx40在肺组织中的阳性表达主要在肺泡间隔中的微血管内皮及肺泡外血管内皮细胞中。 五、肺组织中Cx40蛋白表达水平 Cx40于高氧1d时明显升高，较对照组1d及组内其他时间点均具有显著性差异(P＜0.05)，随高氧暴露时间延长，Cx40蛋白表达量逐渐减低，高氧3d时Cx40表达量仍较对照组明显升高（P＜0.05），于高氧7d时Cx40蛋白明显低于对照组7d(P＜0.05)。 六、肺组织中Cx40mRNA队表达水平 高氧1d时Cx40 mRNA表达水平明显升高，较对照组1d及组内其他时间点具有显著性差异(P＜0.05)，随高氧暴露时间延长，Cx40 mRNA表达量逐渐减少，于高氧5d时表达量最低，高氧7d时其表达较前升高，且明显高于对照组7d的表达量（P＜0.05）。 结论： 1、BPD早期肺水肿阶段存在肺血管内皮紧密连接破坏，可能与肺水肿期血管通透性增加有关。 2、间隙连接蛋白Cx40在大鼠肺组织中主要表达于肺泡间隔中的微血管内皮及肺泡外血管内皮细胞中，其与高氧致肺损伤早期呈代偿性升高，随高氧暴露时间延长，表达逐渐减低，与肺损伤程度变化相一致，推测其可能参与调控肺水肿及炎症发生。
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