摘要
目的: 阐明重楼的主要有效成分重楼皂苷(Ⅰ)(PPI)诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用和机制;研究PPI协同TRAIL诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用和机制。 方法: 1.应用荧光多肽底物Suc-LLVY-AMC，特异性检测PPI对纯化20S蛋白酶体、MG-63细胞分泌的蛋白酶体糜蛋白酶样活性的影响。 2.PPI体外抗骨肉瘤的作用和机制研究:用Countstar细胞计数仪检测不同浓度PPI与MG-63细胞共培养72h后MG-63存活率;用单层培养细胞划痕伤口愈合实验检测PPI(0.625μM)对MG-63细胞迁移能力的影响。用流式细胞术(FCM)检测不同浓度PPI对MG-63细胞凋亡率的影响。用WesternBlot、荧光定量PCR分别检测PPI对MG-63细胞凋亡相关蛋白表达和基因转录的影响。 3.PPI协同TRAIL诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用和机制研究:用显微镜、FCM和WesternBlot分别检测对照组、PPI+PBS处理组、PBS+TRAIL处理组、PPI+TRAIL处理组MG-63细胞形态、细胞凋亡率和细胞凋亡相关蛋白表达。 结果: 1.PPI有效抑制纯化的20S蛋白酶体糜蛋白酶样活性，呈浓度依赖性;同时能显著抑制MG-63细胞所分泌的糜蛋白酶样蛋白酶体活性，呈时间-浓度依赖性。 2.PPI能有效抑制MG-63细胞存活率，随药物浓度的增加抑制率增强;可以抑制MG-63细胞的迁移能力。PPI能有效诱导MG-63细胞发生凋亡，下调Vmentin、Bcl-2蛋白表达，上调Bax、CleavedPARP蛋白表达;下调Bcl-2mRNA表达，上调Caspase-3、PARPmRNA表达。 3.流式细胞仪检测各组MG-63细胞凋亡率:对照组2.56±0.20％、PPI(0.625μM)处理组9.63±2.69％、TRAIL(25ng/ml)处理组8.50±0.90％、PPI(0.625μM)+TRAIL(25ng/ml)处理组50.04±0.32％。PPI+TRAIL处理组可以显著下调Bcl-2蛋白，上调CleavedPARP蛋白的表达，作用强度大于PPI和TRAIL处理组。 结论: 1.PPI是一种有效的蛋白酶体抑制剂。 2.PPI可有效抑制MG-63细胞存活率和迁移能力，通过调节MG-63凋亡关键蛋白和基因表达，诱导细胞发生凋亡，具有良好的体外抗骨肉瘤作用。 3.PPI可显著增强MG-63细胞对TRAIL的敏感性，诱导骨肉瘤细胞凋亡。
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