摘要
柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一，是国内外植物检疫对象。目前主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区，中国19个柑橘生产省（市、自治区）中已有11个受到该病为害，严重制约柑橘产业的健康发展。其病原物暂定为α-变形菌纲韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)细菌，包括亚洲种（‘Ca.L.asiaticus’）、非洲种（‘Ca.L.africanus’）和美洲种（‘Ca.L.americanus’），在我国该病害由亚洲种引起。田间症状表现为病树的黄梢和叶片的斑驳型黄化，果实小，畸形，严重影响柑橘的品质与产量。由于目前尚无有效药剂和抗病品种，主要采取挖除病树、防治木虱和种植无病苗木等防控措施，因此加强柑橘黄龙病的早期诊断显得尤为重要。对柑橘黄龙病菌遗传多态性的评估有助于了解病菌分类、种群结构和发生动态，同时也为病害诊断、病菌检测及风险评估提供了一种灵敏、特异的方法，因此区分‘Ca.L.asiaticus’的不同株系对柑橘黄龙病的生物学和流行学研究是十分重要的。 鉴于国内尚无柑橘黄龙病的环介导等温扩增（LAMP）检测方法，以及中国高海拔地区种群分化研究不足的背景下，本学位论文在国家公益性行业（农业）科研专项(200903004-06;201003067-02)和教育部创新团队（IRT0976）的资助下，基于柑橘黄龙病菌亚洲种omp基因的保守位点，建立了柑橘黄龙病LAMP快速检测方法，并将其应用于田间黄龙病疑似样品的批量检测中，旨在对早期黄龙病作出快速诊断。同时，通过在柑橘黄龙病菌亚洲种‘Ca.L.asiaticus’全基因组上报道的CLIBASIA_05640—CLIBASIA_05660位点对中国不同地理来源的种群进行了遗传多态性评估，进一步探索高海拔地区种群分化情况，以期为黄龙病的起源及流行学提供有力的技术支撑。本研究取得了如下研究成果: 1、利用PrimerExplorer V4在线软件，针对柑橘黄龙病菌亚洲种omp基因的种属特异保守区域设计引物，优化反应体系，建立了柑橘黄龙病菌亚洲种的LAMP快速检测方法。利用该方法对田间柑橘样品进行LAMP扩增，仅HLB阳性样品的扩增产物经电泳呈特征性梯状条带。产物通过浊度观察和SYBR Green I荧光染料显色，可直接判读检测结果。该方法和实时定量PCR最低检出量均为3.9×101拷贝，灵敏度比常规PCR高100倍。在对120份田间黄龙病疑似样品检测中，LAMP检出65份阳性，阳性率为54.2％，PCR检出47份阳性，阳性率为39.2％，PCR检测为阳性的样品，LAMP检测亦为阳性。表明该方法快速简便、特异性强、灵敏度高，为快速检测柑橘黄龙病提供了新方法和新思路。 2、选用已报道的CLIBASIA_05640-CLIBASIA_05660位点，对采自中国8省（市、区）的222份‘Ca.L.asiaticus’阳性样品进行了种群分化评估，发现来自云南和四川的部分株系产生了一条缺失约1033 bp的核苷酸序列，即缺失了2个完整的ORF(CLIBASIA05650和CLIBASIA_05655)以及1个ORF（CLIBASIA_05645）的部分序列，这些株系除该小片段外，还有预期大小的DNA片段，而其它地区的株系只出现大片段。在其侧翼设计下游引物，发现在CLIBASIA_05660（P4噬菌体/质粒引发酶）位置上株系间序列变异很大，在该位点这些株系间都存在明显的差异。同时，继续在其侧翼设计上游引物TR1220342f/TR1222657r，PCR扩增结果发现云南和四川部分株系也产生两条扩增片段，小片段与原噬菌体SC2、FP2序列更为接近，有类似重组的现象，可能是另一种原噬菌体序列。差异的产生主要是由于序列的插入、缺失或重组所致，亦存在多个SNPs，这些均表明云南、四川等高海拔地区种群较广东、广西等低海拔地区种群有更大的基因组可塑性。 综上所述，本研究基于LAMP技术，建立了简便、特异、灵敏的柑橘黄龙病LAMP快速检测方法，可用于田间样品的大规模检测。另外，利用CLIBASIA_05625-CLIBASIA_05660位点进一步对不同地理来源的‘Ca.L.asiaticus’进行了种群分化研究，在已有的基础上重点评估了高海拔地区的典型株系，有望为黄龙病起源、生物学及流行学研究提供分子依据。
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