摘要
家蚕是一种具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫，但面临严重的疾病威胁。家蚕核型多角体病毒(B.morinucleopolyhedrovirus，BmNPV)是对养蚕业危害最严重的一类病原，经常给蚕业生产带来严重经济损失。传统消毒方法可以在一定程度上预防蚕病，但具有很大局限性。培育抗性品种是应对蚕病威胁的有效手段，本研究利用转基因技术培育抗BmNPV的家蚕品种。首先，建立了家蚕抗性检测平台;接着，根据BmNPV的侵染过程，选择不同靶标基因，分别在侵染的四个关键环节对其进行抑制;然后，对四种不同抗病毒策略进行优化和整合，进一步提高家蚕抗性;最后，对蚕业生产现行实用品种进行大规模转基因改良。主要获得以下的研究成果: 1.家蚕抗性检测平台的建立 在制定BmNPV病原的制备标准、桑叶的切割标准、病原的单头添食标准和调查记录标准的基础上，建立了家蚕抗性检测平台。具体操作为:取具有BmNPV感染典型症状的病蚕血液，经创伤感染大批健康5龄起蚕，在其开始出现感染典型症状时收集血液，纯化获得大量BmNPV病毒;将新鲜桑叶切割成标准规格的小片并摆放整齐;准确吸取等量的病毒溶液滴在每片叶块上，涂抹均匀后晾干，将饥饿处理后的起蚕小心地放到涂抹有病毒的桑叶上，一片桑叶对应一头蚕;给桑后2h左右，选择将整片涂有病毒的桑叶食下的个体作为后续检测的对象，并按重复区分区饲养;将饲养过程中出现疑似病征的蚕及时捡出，放置在另一个干净塑料盒中继续观察，确定其是否发病，做好调查记录。标准化的BmNPV病毒提纯流程，能有效避免其他病原的污染，从而确保病蚕表型的可靠性;单头添食保证每头蚕食下病原量一致，避免因个体食下病原量不同给实验结果带来的影响;及时分离可疑病蚕，可有效避免二次感染，保证数据的可靠性。该检测平台具有的这些优点，提高了检测结果的真实性、可靠性和可重复性。 2.增量表达内源基因Bmlipase-1在感染初期抑制BmNPV提高转基因家蚕抗性 Bmlipase-1蛋白具有强烈的抗病毒能力，在BmNPV感染早期发挥抑制作用。在之前的研究中，本实验室已经制备出利用BmNPVIE1启动子(IElP)介导内源抗性基因Bmlipase-1增量表达的转基因系统LI。本研究对LI进行了系统检测。Southernblot和反向PCR结果表明外源片段以单拷贝方式插入在家蚕基因组的基因间区;qPCR检测结果显示，LI-A四龄中肠的Bmlipase-1表达量比正常大造(NmDZ)高27.3％;Westernblot检测结果显示，在四、五龄起蚕肠液中，LI-A的Bmlipase-1蛋白含量明显高于NmDZ;抗性检测结果显示，当四龄起蚕以106个/头经口食下感染BmNPV以后，LI-A的死亡率比NmDZ低33％;qPCR结果显示，LI-A中的病毒DNA拷贝数只有NmDZ的37％左右;幼虫体重变化调查结果显示，LI-A幼虫的生长发育未受到影响;经济性状调查结果显示，LI-A和NmDZ之间的全茧量和茧层率都没有明显区别。以上结果表明，增量表达Bmlipase-1可以显著提高家蚕的抗性而不影响其经济性状。 3.干涉BmNPV基因在mRNA水平抑制病毒提高转基因家蚕抗性 RNAi是一种有效的抗病毒策略，干涉BmNPV基因可以在mRNA转录水平抑制病毒的增殖。某些因素会影响转基因干涉家蚕的抗病毒能力，本论文对这些因素进行了系统比较和分析。转基因干涉载体包括启动子、靶标基因正向片段、间隔序列、靶标基因反向片段和终止信号序列。基因正反向片段与间隔序列的连接模式包括“头对头”和“尾对尾”，本论文制备了IElP介导ieldsRNA和A4P介导gp64dsRNA分别以“头对头”和“尾对尾”模式表达的转基因系统，检测结果表明，在感染BmNPV以后，使用“头对头”模式的转基因家蚕体内靶标基因mRNA量更低、病毒DNA含量更少、抗性更高。启动子对转基因干涉效率具有重要影响，本研究构建了IElP、IElP+hr3和A4P3个不同启动子分别介导gp64dsRNA表达的转基因家蚕，检测结果显示，使用IElP+hr3的转基因家蚕在感染病毒以后的gp64mRNA量最低、病毒DNA含量最少、死亡率最低。靶标基因的选择也会影响转基因干涉效率，BmNPV包括必需基因和非必需基因，同时又可以分为极早期、晚早期、晚期和极晚期基因，本论文选择极早期必需基因ie-1、晚早期必需基因helicase、晚期必需基因gp64和vp39及极早期非必需基因ie-2作为靶标进行比较，结果显示干涉必需基因对病毒增殖的抑制效果更好，在不同时期的靶标基因中，极早期基因是最好的干涉靶标。这些结果显示，利用IElP+hr3介导病毒极早期必需基因dsRNA以“头对头”模式表达可以制备出抗性更好的转基因家蚕。 4.增量表达外源基因hycu-ep32在蛋白合成水平抑制BmNPV提高转基因家蚕抗性 HycuNPV的hycu-ep32基因在共感染细胞系中通过抑制总蛋白合成来抑制BmNPV的增殖。为了确定其能否在家蚕个体中抑制BmNPV的增殖，本研究制备了诱导型启动子(39KP)、增强子+诱导型启动子(hr3+39KP)、组成型启动子(A4P)和增强子+组成型启动子(hr3+A4P)分别介导hycu-ep32增量表达的转基因家蚕EKG、HEKG、EAG和HEAG。RT-PCR结果显示，hycu-ep32在这些转基因家蚕中成功表达，在HEKG-B中的表达量最高;抗性检测结果表明，HEKG和HEAG具有显著提高的抗BmNPV能力，HEKG-B的抗性最好;qPCR结果显示，不管是否感染BmNPV，hycu-ep32在HEKG-B中的表达量都是最高，表明转基因家蚕的hycu-ep32转录量越高，其对BmNPV的抗性越好;hr3在正常转基因家蚕幼虫中可以显著增强39KP的转录活性，而在感染BmNPV以后可以显著增强39KP和A4P的转录活性;qPCR结果显示，所有检测转基因系统体内的病毒含量都显著低于对照，表明BmNPV的增殖受到抑制。跟我们预期的一样，39KP+hr3是所有被检测启动子中最好的一个，HEKG-B的hycu-ep32表达量在正常状态下比较低，但在感染BmNPV后随着病毒量的增加而显著增加，从而使家蚕对BmNPV的抗性显著提高，而且经济性状没有受到影响。 5.干涉BmPGRP2激活宿主先天免疫反应提高转基因家蚕对BmNPV的抗性 肽聚糖识别蛋白(PGRP)是昆虫的主要模式识别受体之一，具有激活体液免疫信号通路、参与酚氧化酶原级联反应等功能。基于基因组生物信息学和芯片数据分析，本研究克隆了家蚕BmPGRP2基因，发现其具有两种选择性拼接形式BmPGRP2和BmPGRP2a，这是首次克隆到具有选择性拼接的家蚕模式识别受体基因。BmPGRP2a具有一个包含了BmPGRP25'UTR的长5'UTR，说明这两种拼接形式很可能是由不同转录起始位点引起的。 亚细胞定位结果显示，BmPGRP2蛋白分布于整个细胞，而BmPGRP2a只定位在细胞膜;时期表达模式检测结果表明，BmPGRP2a在家蚕幼虫阶段的表达量低于BmPGRP2，但在卵期、蛹期和蛾期高于BmPGRP2;组织表达模式检测结果显示，BmPGRP2和BmPGRP2a在雌蚕组织中的表达量高于雄蚕组织，在中肠的表达量都是最低的，BmPGRP2的表达量在中肠低于BmPGRP2a，而在其他组织高于BmPGRP2a。BmPGRP2基因具有不同选择性拼接形式、定位在胞内（或膜上），表明其属于PGRP-L亚家族。BmPGRP2和BmPGRP2a这两种不同拼接形式的亚细胞定位和时空表达模式不同，暗示它们可能行使不同功能。 在NCBI进行blast比对，没有发现与BmPGRP2相似的基因，说明这是一个新基因;进化分析发现它单独聚为一枝，暗示它的功能可能与其他已知基因不同。品种比较分析发现，BmPGRP2和家蚕的抗病毒能力有一定关系，在抗性高的蚕品系中，BmPGRP2的表达量低。为了探究降低BmPGRP2表达量是否可以提高家蚕抗性，本实验利用家蚕932品种制备了干涉BmPGRP2的转基因家蚕PGRP2I。qPCR结果显示，转基因家蚕的BmPGRP2表达量显著下调;抗性检测结果表明，转基因系统的抗性显著提高，PGRP2I-2感染BmNPV以后的死亡率比932低30％以上;qPCR结果显示，PGRP2I-2可以显著抑制BmNPV的复制增殖，其病毒DNA含量仅为对照的45％左右;全茧量和茧层率调查结果显示，干涉BmPGRP2没有影响家蚕的经济性状。这些结果表明，BmPGRP2参与了家蚕对病毒的先天免疫反应，可以通过降低家蚕体内的BmPGRP2表达量来提高家蚕抗性。 在感染BmNPV以后，正常家蚕体内的BmPGRP2被诱导上调表达，而Imd和Toll通路的基因没有被诱导。在转基因干涉家蚕PGRP2I-2中，虽然BmPGRP2也被BmNPV诱导上调，但其上调后的表达量和932正常状态下的表达量没有显著差异，导致BmImd和BmPelle被诱导显著上调。这些结果表明，干涉BmPGRP2使家蚕的某条免疫信号通路在感染BmNPV后被激活。在PGRP2I-2中，Imd和Toll通路的其他基因在感染BmNPV以后没有被诱导上调，暗示BmImd和BmPelle参与的这个免疫信号通路有可能是一个新的通路。 6.不同抗病毒策略的优化和整合 增量表达Bmlipase-1、干涉病毒基因、增量表达hycu-ep32、干涉BmPGRP2，可以分别在病毒侵染早期、病毒mRNA转录水平、病毒蛋白合成水平、调控宿主先天免疫防御等四个方面抑制BmNPV增殖并提高家蚕抗性。为了进一步提高家蚕的抗性，本论文对这四种策略进行了优化和整合。利用IElPielH-B、HEKG-B和PGRP2I-2的纯合个体分别进行杂交，抗性检测结果显示，两两杂交后代的抗性没有显著高于纯合亲本。所以，本论文构建了改进型转基因载体pb-HFPL，在hr3增强子的作用下，IElP介导ie1、gp64、lef1、lef2和DNApolymerase等5个病毒基因的串联干涉，家蚕中肠特异启动子P2介导Bmlipase-1的增量表达;通过注射实用品种芙蓉(SW)制备了转基因系统SW-H。qPCR结果显示，在3龄起蚕整蚕和5龄起蚕中肠，SW-H的Bmlipase-1表达量分别比非转基因SW高40％和90％左右，SW-H的Bmlipase-1表达量显著提高，表明其可以在感染初期抑制病毒。在3龄起蚕以5×105个/头经口添食感染BmNPV后，SW-H体内ie-1和gp64的mRNA量分别为SW的17％和25％左右，显示SW-H体内的病毒mRNA量被显著降低，表明其通过干涉病毒基因能够在增殖阶段抑制病毒;SW-H体内的病毒含量不到SW的20％，表明转基因系统显著抑制了病毒的复制增殖;SW-H1的存活率比SW高78％，表明转基因系统的抗性显著提高。SW-H的抗性显著提高而经济性状没有受到影响，说明可以通过同时增量表达抗性基因和干涉病毒基因来进一步提高家蚕的抗性。SW-H是第一个能在感染的多个阶段抑制病毒的转基因高抗病毒动物。进而，本论文构建了一个整合四种抗病毒策略的转基因载体pb-KNT，在hr3作用下，利用39KP介导hycu-ep32的增量表达，利用IElP介导BmPGRP2和4个病毒基因ie-1、gp64、helicase、lef-1的串联干涉，利用P2介导Bmlipase-1的增量表达。利用pb-KNT载体制备的转基因家蚕将在BmNPV侵染的四个不同阶段同时抑制病毒，有望培育出高抗BmNPV的转基因家蚕品种。 7.蚕业生产现行实用品种的转基因改良和安全思考 为了将基础研究成果向应用成果进行转化，本论文选取重庆、四川、广东、广西等蚕业主产区使用范围比较广的家蚕品种“苍海·日月”、“781×7532”、“夏芳·秋白”、“两广二号”等进行第一批转基因改良，在显微注射pb-HFPL载体后，成功制备了大部分品种的转基因品系。利用pb-KNT载体对蚕业生产现行实用品种进行大规模转基因改良，培育高抗BmNPV的转基因家蚕品种的工作也正在进行中。家蚕是完全驯化动物，只能在室内饲养，而且在长期的养蚕历史中没有不安全的记录。因此，家蚕的安全等级可能为Ⅰ，转基因家蚕及其产品的安全等级也可能为Ⅰ。为了评估转基因家蚕的安全性，按照农业部转基因生物安全管理条例的要求，本实验室目前正在申请对IElPielH-B、HEKG-B、PGRP2I-2等基础抗性素材和以SW-H为代表的改进型抗性品系进行安全检测中间试验。我们将严格按照国家法律法规的要求，对这些转基因品系进行严格的检测和评价，争取早日取得转基因抗性品种的安全证书并将其应用于蚕业生产。
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