摘要
第一部分纳米金颗粒的制备及其检测 目的: 制备符合实验要求的并具有肿瘤靶向作用的纳米金颗粒，用于肺癌体外放射治疗的研究。 材料与方法: 1.该实验在纳米金颗粒的制备中采用了经典的水相氧化还原法，即以高价金离子（四氯金酸HAuCl4）为原材料，在特定的严格的条件下（温度140℃左右，磁子搅拌速度300rpm），在其水溶液中加入还原剂柠檬酸三钠，金离子被还原成金原子(Au)，并聚集成纳米颗粒(GNPs)。根据实验需要，在合成后的GNPs的水溶液中加入一定浓度的巯基葡萄糖(Glu)溶液，常温下静置24小时，使其与GNPs充分结合，从而形成最终所需的结构较为稳定的巯基葡萄糖-纳米金颗粒(Glu-GNPs)。 2.合成后的GNPs通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)观察并分析其形态、分布及大小;利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测定其浓度;利用X射线光电子能谱分析(XPS)检测巯葡萄糖是否与纳米金颗粒结合，并利用由此得到的各项参数计算出Glu-GNPs中金元素与硫元素的数目的比值，即可代表每个纳米金颗粒所携带的巯基葡萄糖分子的个数。 结果: TEM可见实验中合成的纳米金颗粒大小均匀，分散性良好。通过Origin分析软件计算其直径约为13±2.2nm;DLS测定其直径约为15±1.8nm。两者之间存在的差异原因是TEM所观察的是烘干后的纳米金颗粒，测量的是纳米金颗粒核心的直径，而DLS检测时将纳米金颗粒外周的水膜计算在内。ICP-AES测定制备的纳米金颗粒溶液的浓度为36.9μg/ml。XPS数据显示巯基葡萄糖与GNPs成功结合，并且计算得出每个纳米金颗粒携带约2.3×104个巯基葡萄糖分子。 结论: 通过多方面严格的检测，本实验成功地合成符合要求的大小均匀（约15nm）、分散性良好、性质稳定的纳米金颗粒，并且成功将巯基葡萄糖分子稳定地偶联在纳米金颗粒的表面，合成实验最终所需的具有肿瘤靶向作用的Glu-GNPs。 关键词:四氯金酸;水相氧化还原法;纳米金颗粒;巯基葡萄糖 第二部分纳米金对A549细胞的放疗增敏作用及其机制 目的: 研究A549细胞对裸GNPs(未偶联葡萄糖的纳米金颗粒，以下均简称为GNPs)及Glu-GNPs的摄取;Glu-GNPs在A549细胞内的分布;MTT实验检测Glu-GNPs对细胞的毒性作用;MTT实验及克隆形成实验观察Glu-GNPs对A549细胞的放疗增敏作用;利用流氏细胞技术检测Glu-GNPs对A549细胞周期分布的影响及细胞凋亡的变化;利用Westernblot技术检测凋亡相关蛋白的表达，从分子水平进一步探索Glu-GNPs增加A549细胞对放射治疗敏感性的机制。 材料与方法: 1.将一定浓度的Glu-GNPs加入对数生长巾的A549细胞中，培养24小时后，离心收集细胞，制备石蜡切片，在TEM下观察Glu-GNPs在细胞内的分布; 2.培养A549细胞，分为对照组、GNPs组及Glu-GNPs组，药物浓度为5nM。分别于培养后不同时间(6h，12h，24h，48h)收集细胞并计数，硝酸裂解细胞，ICP-AES测定溶液巾金元素的含量。以此计算A549细胞在不同时间点分别对GNPs及Glu-GNPs的摄取量; 3.取处于对数生长期的A549细胞，分别加入不同浓度(0nM，5nM，10nM，20nM)的Glu-GNPs，MTT实验检测细胞在培养不同时间后(24h，48h，72h)的存活分数; 4.将不同浓度(0nM，5nM，10nM，20nM)Glu-GNPs处理下的A549细胞置于6MVX线下照射，剂量为10Gy，用MTT的方法观察与射线联合后不同浓度的Glu-GNPs对A549细胞的放疗增敏作用; 5.将不同数目的A549细胞(50，200，400，1000，2000，5000)种植于6孔板中，浓度为20nM的Glu-GNPs作用24h后，更换培养液，根据不同细胞数目分别给予不同的照射剂量(0Gy，2Gy，4Gy，6Gy，8Gy，10Gy)，培养2周，待细胞克隆形成后，数克隆数目并绘制细胞克隆形成曲线，从而观察Glu-GNPs对A549细胞的放疗增敏效应; 6.取对数生长的A549细胞，分为对照组，单纯加药组(20nMGlu-GNPs)，照射组(IR)及联合组(Glu-GNPs+IR)，处理后收集细胞，PI染色，流氏细胞仪检测各处理组细胞周期分布的变化; 7.取对数生长的A549细胞，分为对照组，单纯加药组(20nMGlu-GNPs)，照射组(IR)及联合组(Glu-GNPs+IR)，处理后收集细胞，Annexin(V)及PI染色，流氏细胞仪检测各组细胞凋亡的变化; 8.取对数生长的A549细胞，分为对照组，单纯加药组(20nMGlu-GNPs)，照射组(IR)及联合组(Glu-GNPs+IR)，处理后收集细胞，蛋白提取并变性，利用Westernblot技术检测各组细胞凋亡相关蛋白，包括Bcl-2，Bax及cleavedcaspase-3蛋白表达的变化。 结果: 1.TEM下可见Glu-GNPs主要分布于A549细胞的细胞浆巾，并呈聚集状态附着于胞浆内有膜细胞器—溶酶体或内涵体的表面，; 2.A549细胞对GNPs及Glu-GNPs的摄取在培养24小时均达到高峰，并且在任一所选取的时间点（6h除外），对Glu-GNPs的摄取量要明显多于GNPs(P＜0.05)。 3.随着Glu-GNPs的浓度的增加及时间的递增，A549细胞的存活率未受到明显的抑制（P＞0.05）; 4.在一定的照射剂量下，A549细胞的存活率随着Glu-GNPs浓度的增加而降低（P＜0.05），与浓度呈负相关; 5.细胞克隆实验表明，在一定的Glu-GNPs浓度下，Glu-GNPs+IR组的Dq、D0及SF2均明显低于IR组（P＜0.05），SER为1.49。Glu-GNPs可以明显提高A549细胞的放疗敏感性; 6.流氏细胞技术检测细胞周期的结果显示联合组细胞G2/M期细胞比例明显高于单纯照射组(P＜0.05)，Glu-GNPs可以将A549细胞阻滞在对放射较为敏感的G2/M期，提高其放射敏感性; 7.流氏细胞技术检测细胞凋亡的结果显示联合组细胞凋亡率明显高于单纯照射组(P＜0.05)，Glu-GNPs可能通过提高放射线诱导的A549细胞的凋亡来提高其放疗敏感性; 8.Westernblot检测结果显示单纯加药组较对照组、联合组较单纯照射组，其细胞内Bcl-2蛋白的表达均呈下降趋势，而Bax及cleavedcaspase-3蛋白的表达均有所增加(P＜0.05)。 结论: 根据肿瘤细胞对葡萄糖高代谢的特点，我们将葡萄糖分子利用巯基与纳米金颗粒偶联，从而使纳米金颗粒更加准确、有效地被A549细胞摄取。实验结果表明，将巯基葡萄糖分子结合在GNPs的表面可以明显提高A549细胞对GNPs的摄取;细胞摄取Glu-GNPs后，主要呈聚集状态分布于细胞浆内有膜细胞器的表面，如内涵体及溶酶体。Glu-GNPs在浓度低于20nM时对A549细胞的生长无明显的抑制作用(P＞0.05)。Glu-GNPs能明显提高A549细胞对6MVX射线的敏感性，其机制不仅涉及到细胞周期的改变，即G2/M期细胞比例的增加;而且Glu-GNPs增加了放射线诱导的A549细胞的凋亡。Glu-GNPs对细胞凋亡的调控可能与凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白的下调以及Bax及cleavedcaspase-3蛋白的上调相关。总之，Glu-GNPs作为一种新型的放疗增敏剂，能够增强射线对A549细胞的杀伤作用。该作用的实现可能是通过对细胞周期的调控以及与caspase-3蛋白的活化和线粒体途径相关的凋亡途径来实现的。 关键词:纳米金颗粒;A549细胞;放射增敏;细胞周期;凋亡
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