摘要
研究背景： 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是严重危害人类健康的疾病，其中易损斑块是急性冠脉综合征(acutecoronarysyndrome，ACS)以及脑血管疾病的基础病变，易损斑块发病机制和治疗靶点的探索成为当今医学发展的重大挑战。动脉粥样硬化斑块的主要细胞成分包括巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。易损斑块的病理改变包括平滑肌细胞和胶原纤维含量减少，有大的脂质核，斑块内大量的巨噬细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润。 越来越多的研究表明离子通道与血管功能密切相关，在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥重要作用。已有研究报道，内皮细胞钙离子通道、钾离子通道和氯离子通道在剪切力应激和炎症反应中具有调节作用;TRPC通道介导的血管平滑肌细胞、内皮细胞、单核/巨噬细胞和血小板功能失调参与了动脉粥样硬化的病理过程。由此可见，离子通道在动脉粥样硬化中的作用不容忽视。而且，钾离子通道是膜电位的重要组成部分，在维持细胞电稳态中具有重要作用，可以调节细胞内钙离子的浓度进而发挥对细胞功能的调节作用。 三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate，ATP)敏感的钾通道(KATP)是由四个孔道形成亚基-Kir6亚基和四个调节亚基-SUR亚基组成的八聚体蛋白。对细胞内腺苷酸变化敏感，是重要的代谢感受器，偶联细胞内代谢状态与细胞膜电活动。近年来，KATP通道在糖尿病和心血管疾病中同时发挥的重要作用逐渐得到认可，作为几类不同药物的作用靶点，成为研究活跃的领域。现有的研究主要集中在以下几个方面:心脏功能的调节，包括缺血再灌注、心肌梗死、心肌重构、心衰、缺血预适应和应激的环境中心肌细胞KATP通道的调节作用;血管平滑肌细胞的KATP通道研究也很丰富，包括各种内源性和外源性血管舒缩物质的调节作用以及在高血压和感染的环境中的表达和功能的改变;同样的，血管内皮细胞的KATP通道也越来越受到重视，包括在内皮素和NO释放中的调节作用研究。但是，对于KATP通道在动脉粥样硬化中的作用却没有直接的报道。 因此，本研究提出如下假说:KATP通道在动脉粥样硬化病变的病理生理过程中发挥重要作用，KATP通道可能成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。 目的： 1.建立动脉粥样硬化病变发展的动物模型; 2.观察斑块平滑肌细胞、巨噬细胞、胶原纤维和脂质表达，评测斑块易损性; 3.探讨KATP通道药物体内干预对动脉粥样硬化病变发展的影响。 方法： 本研究以ApoE-/-小鼠80只为研究对象，9周龄始予高脂饮食，10周龄时(25-30g)行右侧颈动脉套管术;8周后，高分辨率小动物显微超声检测颈动脉斑块病变，随后，小鼠随机分为空白对照组，转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.lacZ对照组和转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.p53实验组，后两组分为转染后1天组、4天组和14天组，转染后4天组和14天组又分为格列苯脲（Glibenclamide）干预组和非干预组，给予相应处理。检测下列指标: 1.血生化分析:血液标本收集，检测血糖(glucose，Glu)、谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase，GPT）、谷草转氨酶(glutamicoxaloacetictransaminase，GOT)、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(totalcholesterol，TC)含量; 2.ApoE-/-小鼠取材，病理组织学检测:实验动物按照实验分组，分别于转染后0天、1天、4天和14天时处死，留取组织用于病理染色及分子生物学实验。苏木素-伊红(hematoxylinandeosin，HE)染色用以检测组织结构变化，油红O(Oil-redO)染色用以检测组织脂质含量，天狼猩红(Sirius-red)染色用以检测组织胶原纤维含量，p53、SMC-αactin、MOMA-2的免疫组织化学染色分别用以检测组织p53的表达、平滑肌细胞和巨噬细胞的含量; 3.计算斑块易损指数:易损指数=（MOMA-2阳性面积/斑块面积+脂质面积/斑块面积）/（SMC-αactin阳性面积/斑块面积+胶原纤维面积/斑块面积）。 结果： 1.格列苯脲干预对ApoE-/-小鼠血生化及肝脏组织的影响 格列苯脲灌胃后小鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇、转氨酶水平以及肝脏组织结构没有明显变化（P＞0.05）。 2.ApoE-/-小鼠颈动脉套管手术及p53转染效率检测 小鼠显微超声示右侧颈动脉套管及套管近心端斑块形成;转染后1天、4天、14天，p53表达在Ad5-CMV.p53转染组比Ad5-CMV.lacZ组明显增多（P＜0.05）。 3.ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块平滑肌细胞及胶原纤维染色 斑块平滑肌细胞含量与胶原纤维含量变化趋势基本一致，在p53转染4天和14天组明显少于相应时间点的lacZ转染组(P＜0.05)。 4.ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块巨噬细胞及脂质染色 斑块巨噬细胞含量与脂质含量变化趋势一致，在转染后4天和14天时，p53组显著高于相应时间点的lacZ组(P＜0.05)。 5.ApoE-/-小鼠格列苯脲体内干预稳定颈动脉粥样硬化斑块 格列苯脲体内干预14天，在p53转染组巨噬细胞含量、脂质含量明显降低(P＜0.05)，斑块胶原成分显著增加（P＜0.05），尽管平滑肌细胞含量无明显变化（P＞0.05），但是斑块病变改善显著。 6.斑块易损指数计算 在转染后4天和14天时，p53组易损指数比lacZ显著升高，而且时间点愈后p53转染组的易损指数升高愈显著(P＜0.05);在p53转染14天组，格列苯脲体内干预使易损指数明显下降(P＜0.05)。 结论： 1.ApoE-/-小鼠高脂饮食、颈动脉套管术后局部转染Ad5-CMV.p53诱导斑块易损指数增加; 2.格列苯脲体内干预对Ad5-CMV.p53转染ApoE-/-小鼠血生化及肝组织结构无明显影响; 3.ApoE-/-小鼠格列苯脲体内干预改善p53转染诱导的颈动脉粥样硬化斑块病变。
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