摘要
中国是目前世界上拥有牦牛数量最多的国家，牦牛资源十分丰富，仅《中国牛品种志》中收录的优良品种就有5个，而有代表性的优良类群就达11个之多，因此中国牦牛群体遗传多样性一直是人们研究的热点，并采用血液蛋白多态、微卫星标记、线粒体D-loop区序列、细胞色素b基因序列和核基因序列进行了分析，但基于线粒体基因组全序列探讨中国主要牦牛品种遗传多样性的研究还未见报道。牦牛是青藏高原及其周边地区畜牧业经济发展不可或缺的畜种，为当地牧民提供肉、奶、毛、役力、燃料等生产和生活必需品，但其生产性能较低，通过与黄牛杂交可大幅度提高其乳、肉等生产性能，然而F1代公犏牛雄性不育，因此阐明犏牛雄性不育的机制对牦牛杂交改良和杂种优势利用，以及提高牧民生活水平等具有重要意义。目前关于犏牛雄性不育机制的研究主要集中在精子发生减数分裂相关的核基因上，关于线粒体与犏牛雄性不育关系的研究还未见报道。 为了进一步研究中国牦牛品种遗传多样性以及线粒体基因组与犏牛雄性不育的关系，本文拟采用克隆测序和文献追踪等方法获得中国5个主要牦牛品种(西藏高山牦牛、九龙牦牛、麦洼牦牛、青海高原牦牛和天祝白牦牛)36个个体和4个犏牛个体的线粒体基因组全序列，分析中国牦牛线粒体基因组的基因组成和序列特征、中国牦牛品种遗传多样性和遗传分化，比较牦牛和犏牛线粒体基因组之间的差异，为揭示中国牦牛种质特性和雄性不育分子机制提供依据。主要研究结果如下: 1.中国牦牛线粒体基因组全序列分析 通过克隆测序获得了西藏高山牦牛线粒体基因组全序列，发现牦牛线粒体基因组全长16324bp，由13个编码蛋白基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个非编码区组成，基因组成、排列方式和位置均与牛亚科其它物种基本一致。牦牛线粒体13个编码蛋白基因序列长度为11400bp，发现4种起始密码子，大多数编码蛋白基因(9个)均以ATG为起始密码子，ND2、ND3和ND5基因以ATA为起始密码子，ND6基因以AAT为起始密码子。牦牛线粒体非编码区序列全长为893bp，定位在tRNA-Pro与tRNA-Phe之间，与牛亚科其它物种一样由终止序列区(ETAS)、中央保守区(CD)和保守序列区(CSB)组成，但牛亚科不同物种间非编码区序列长度具有物种特异性。牦牛线粒体22个tRNA基因序列长度在66-75bp之间，总长度为1511bp。牦牛线粒体基因组包括2个rRNA基因，即12s rRNA和16s rRNA基因，长度分别为957bp和1571bp。 2.中国牦牛品种线粒体基因组遗传多样性与遗传分化 在36个中国牦牛线粒体基因组全序列中共发现222个变异位点，多态位点百分率为1.36％。中国牦牛线粒体基因组全序列中发生转换44次，颠换2次，转换/颠换(Ts/Tv)比值为18.11，大于转换/颠换比临界值(2.0)，说明中国牦牛线粒体基因组的突变未达到饱和状态。36个牦牛线粒体基因组全序列可定义为30个单倍型，单倍型多样度(Hd)为0.984，核苷酸多样性(Pi)为0.284％，平均核苷酸差异数目(k)为46.3，可见中国牦牛的遗传多样性较丰富。在5个牦牛品种中，多态位点在4-170个之间，单倍型多样度(Hd)在0.833-1.000之间，核苷酸多样性(Pi)在0.025-0.486之间，平均核苷酸差异数目(k)在4-76.4之间，其中麦洼牦牛的多态位点数、单倍型多样度、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数目均最高，说明在中国5个牦牛品种中麦洼牦牛的遗传多样性较丰富。中性检验发现中国牦牛群体和5个牦牛品种线粒体基因组全序列符合中性突变，种群的群体大小基本保持稳定，没有出现过种群扩张和持续增长模式。中国牦牛5个牦牛品种间的遗传距离在0.002-0.088之间，平均为0.031，其中麦洼牦牛与其它3个品种间的遗传距离最大。中国牦牛群体的遗传分化系数(Gst)为0.0242，基因流为10.08，说明中国牦牛品种间遗传分化不明显，但麦洼牦牛与中国其它牦牛品种间的分化最明显。 3.牦牛与犏牛线粒体基因组比较分析 通过克隆测序技术获得了4个犏牛线粒体基因组全序列，长度在16339bp-16443bp，与牦牛之间存在明显差异。在牦牛和犏牛间线粒体基因组全序列中共发现784个差异位点，其中非编码区47个，编码蛋白基因中619个，tRNA基因中39个，rRNA基因中79个。在非编码区中， ETAS2的差异最大，而CSB2、OH、LSP和HSP等在牦牛和犏牛间均高度保守。与牦牛线粒体非编码区相比，犏牛非编码区有2个较长的碱基插入，分别位于ETAS1前以及ETAS2和CD之间。在编码蛋白基因619个差异位点中，非同义突变位点92个，引起81个氨基酸残基发生改变;92个非同义突变位点中35个引起牦牛和犏牛间氨基酸残基的类型发现改变，其中ATP6蛋白中氨基酸残基类型改变比例最大，为1.76％，而COI、ND3和ND6蛋白未发生氨基酸残基类型的改变。在tRNA基因中，tRNA-Asn基因中的差异位点最多，而tRNA-Val等6个基因则完全一致;二级结构分析差异位点在D环、TΨC环、中央环、受体臂及反密码子臂等处均有分析;在tRNA-Asn基因nt60处和tRNA-Leu(CUN)基因的nt21处各发现1个碱基插入/缺失。在rRNA基因中，12S rRNA中有19个差异位点位于二级结构的loop区，8个位于stem区;16S rRNA中有38个位于loop区，14个位于stem区。
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