摘要
水稻是最常见的粮食作物，在世界范围内许多地方广泛种植。但由于含砷地下水的灌溉、含砷农药使用以及采矿等原因，造成水稻土中砷污染在世界范围内也具有一定的普遍性。水稻一般种植在淹水的厌氧环境下，土壤中砷的有效性较高;同时其根系硅通道对亚砷酸盐(As(Ⅲ))具有高效吸收的能力，导致水稻往往要比一般的粮食作物富集更高含量的砷，已经成为世界范围内最主要的砷的食物暴露途径。本实验采用室内培养的方法，应用定量PCR、克隆文库和限制性片段长度多态性(T-RLFP)等分子生物学手段结合化学分析手段对水稻中砷的吸收和转运，水稻根际微生物介导下砷的氧化、还原和甲基化的过程，以及其影响因素进行了研究，以期更深入地了解水稻根际砷的转化、水稻中砷的吸收转运，为降低水稻中砷的累积提供理论基础和现实指导。实验取得了以下几个方面的结果: (1)通过水培实验研究不同形态的砷在水稻中的吸收、运移以及通过根系的外排过程。砷酸盐(As(Ⅴ))在水稻体内被迅速的还原为As(Ⅲ);而甲基砷(单甲基砷盐(MMAs(Ⅴ))、二甲基砷盐(DMAs(Ⅴ))在水稻体内的形态变化较少。甲基砷(MMAs(Ⅴ)和DMAs(Ⅴ))通过根系外排的速率和比例明显的要高于无机砷(As(Ⅲ)和As(Ⅴ))，解释其在水稻积累总量低于无机砷的原因;甲基砷DMAs(Ⅴ)具有较高的转移系数，可以解释常见水稻籽粒中高甲基砷含量的原因。实验证明不同形态砷在水稻中的积累与其吸收、转运以及外排过程密切相关。 (2)采用无菌培养以及双室气态砷捕集装置研究了水稻—土壤系统中砷的挥发以及形态。无菌基质中添加氧化三甲基砷(TMAs(Ⅴ)O)的处理中观察到水稻中三甲基胂(TMAs)的挥发，但是添加其它形态砷的处理中(包括As(Ⅴ)、MMAs(Ⅴ)和DMAs(Ⅴ))并未观察到砷的挥发。水稻体内未发现无机砷向甲基砷的转化，同时甲基砷向无机砷转化的比例也较低。水稻土中检测到不同形态的甲基砷，包括DMAs(Ⅴ)、MMAs(Ⅴ)以及TMAs(Ⅴ)O等，为水稻中不同形态砷的吸收提供来源。TMAs(Ⅴ)O进入水稻之后可以被还原为TMAs挥发出来，但是通过水稻挥发出来的量仅占整个水稻土壤系统中砷挥发总量很小的一部分，对降低水稻中砷的累积作用不大。 (3)设计特异性引物、采用微生物生态的研究方法对水稻根际砷的甲基化微生物进行了分析。针对已知的砷甲基化酶(ArsM)保守区域设计了3个前引物和3个后引物，并成功的从不同的砷污染和砷背景值的土壤中检测到arsM基因的存在，其丰度大概为107～108基因拷贝/克干土。arsM基因系统发育树与微生物16S rDNA的发育树存在着一些不一致之处，说明arsM可能存在着基因水平转移(HGT)。arsM基因水平转移可能是促进微生物砷抗性一个重要原因，同时在砷的地球化学循环中起到了重要的作用。进一步应用定量PCR、克隆文库和T-RLFP等微生物生态研究手段对水稻根际微生物砷的甲基化过程进行了研究，揭示了水稻根际甲基化基因的丰度和丰富的多样性。arsM基因受到根际和秸秆添加的促进作用，解释了水稻中通常较高的甲基砷累积的原因。 (4)应用定量PCR、克隆文库和T-RLFP等对两种不同根系泌氧量水稻品种根际微生物的砷氧化还原过程进行了研究。根际土壤细菌的丰度(16S rRNA)平均要比非根际土壤提高59.2％;根际砷还原酶基因(arsC)提高50.8％;砷呼吸还原酶基因(arrA)提高20.8％;砷氧化基因(aroA-like)提高120.9％，表明根际环境对微生物砷氧化过程具有更强的促进作用。特别是在杨稻根际中，砷氧化基因的丰度要显著的高于农垦，可能是由于其具有更强的根际泌氧的能力，在根际形成更适合砷氧化微生物生存的环境。根际土壤中和根系表面的砷氧化微生物主要属于α-和β-变形菌门(主要是根际好氧微生物)。典型对应分析(CCA)表明根际效应是根际砷氧化微生物群落的最主要的决定因素，其次是秸秆的添加、水稻生长时间以及水稻品种等因素。实验证明根际微生物砷氧化过程可以促进砷在水稻根际的固定(氧化铁共沉淀)，降低砷的植物有效性以及水稻对砷的吸收;根际泌氧量大的水稻品种更适宜在砷污染区域种植。 (5)研究了水稻土中有机质添加对砷形态转化以及水稻中砷积累的影响，分析了主要的影响因子。水稻土壤中添加沼液、秸秆和酒糟等有机质显著的提高了水稻中砷的含量。以沼液为例，沼液向土壤中的添加提高了土壤溶液中可溶性的有机质(DOC)与Fe(Ⅱ)的含量，并且与土壤溶液中砷的含量显著相关(P＜0.01)。沼液的添加同时显著的提高了土壤的pH，降低了土壤的氧化还原电位(Eh)，都协助提高了土壤中砷的有效性，提高了水稻对砷的累积。有机质添加提高了土壤溶液中DMAs(Ⅴ)和MMAs(Ⅴ)的含量以及TMAs的挥发，土壤中砷甲基化作用的增强进而促进了水稻种甲基砷的含量的提高，水稻籽粒中和稻壳中甲基砷含量的比例提高分别达到99.7-112.2％和105.8-105.9％。实验结果表明有机质在砷污染水稻土壤中的施用要慎重，可能会造成水稻中砷累积的增加。 不同形态的砷在水稻中的吸收、转化、挥发具有显著不同的特征;根际微生物介导的砷的氧化、还原和甲基化过程深刻影响水稻的形态和植物有效性，决定着水稻中不同形态砷的累积。本研究对理解砷在水稻中的累积机制，以及控制水稻中砷累积具有重要的理论和指导意义。
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