摘要
阿魏酸酯酶是参与木质纤维素降解的重要酶类之一，其能够水解半纤维素中的羟基肉桂酸与阿拉伯木聚糖和某些胶质形成的酯键。目前，文献已报道了来源于多种微生物的阿魏酸酯酶并广泛地应用于生物燃料制备，药物合成，有机食品生产，造纸等行业。来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A是研究和应用最多的阿魏酸酯酶之一，其酶学特性、晶体结构结构及其应用方面都得到了深入的研究。酶的热稳定性是在工业应用中的一个重要参数，其直接影响到生产过程的经济性。为了提高来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A的热稳定性以促进其在工业上的应用，本课题通过计算机辅助设计和定向进化手段成功地对其热稳定性进行了改造。 利用反转录聚合链式反应(RT-PCR)技术从黑曲霉的总RNA扩增出了编码阿魏酸酯酶A的cDNA。将阿魏酸酯酶A的编码序列与表达载体连接后转化入毕赤酵母中，成功地表达了阿魏酸酯酶A。利用底物阿魏酸对硝基苯酚酯，我们构建了阿魏酸酯酶A酶活的快速检测方法，为后期的阿魏酸酯酶A的热稳定性体外分子改造提供了实验基础。 为了提高阿魏酸酯酶A的热稳定性，利用近十年来兴起的蛋白质热稳定计算机辅助设计的手段改造阿魏酸酯酶A。利用已报道来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A的晶体结构信息，使用PoPMuSiC在线工具对氨基酸突变对阿魏酸酯酶A热稳定性的影响做出分析并根据其容积接触率和自由能的变化从中选取了四个可能对阿魏酸酯酶A热稳定有较大影响的氨基酸突变(D93G、S92A、D174A和S187F)。实验结果表明氨基酸突变D93G和S187F分别提高了阿魏酸酯酶A的热失活半衰期1.2倍和7.6倍。对这两个氨基酸突变的整合使阿魏酸酯酶A热失活半衰期提得了9.6倍，最适反应温度提高了6℃。另外，氨基酸突变D93G和S187F使阿魏酸酯酶A的酶比活分别提高了1.5倍和9.5倍。 为了利用定向进化手段进一步提高阿魏酸酯酶A的热稳定性，我们合成了四种带有显色基团或荧光基团的模拟底物（阿魏酸对硝基苯酚酯、2-氯对硝基苯酚酯、阿魏酸香豆素阿拉伯糖苷酯和阿魏酸2-氯-对硝基苯酚阿拉伯糖苷酯）用以构建阿魏酸酯酶A随机突变库的高通量筛选体系，其中阿魏酸2-氯对硝基苯酚酯和阿魏酸香豆素阿拉伯糖苷酯为首次报道的新型底物。对四种底物在高通量筛选条件下的稳定性、灵敏度和操作成本等方面进行比较后，我们选择了以合成简单且具有较好的显色能力的底物阿魏酸2-氯对硝基苯酚酯用以阿魏酸酯酶高通量筛选体系的构建。用在96孔板中表达的阿魏酸酯酶A突变体(D93G/S187F)的酶液对以阿魏酸2-氯对硝基苯酚酯为底物的高通量筛选体系进行评价，结果表明该体系具有较好的稳定性和灵敏度。以阿魏酸酯酶A突变体(D93G/S187F)的编码序列为母本随机突变后构建突变库并利用以阿魏酸2-氯对硝基苯酚酯为底物的高通筛选体系筛选10000个克隆后得到了12个使阿魏酸酯酶A热稳定性有不同程度提高的氨基酸突变。其中，氨基酸突变C235S对阿魏酸酯酶A热稳定性有较大影响，这可能是由于该突变使阿魏酸酯酶A的更容易复性引起的。对该12个氨基酸进行整合的阿魏酸酯酶A突变体M12的热稳定与母本阿魏酸酯酶A的热稳定相比有大幅度的提高。其在55℃处理4000分钟后，其残余酶活仍保留90％以上，而母本阿魏酸酯酶A在55℃处理15分钟后酶活即丧失50％;与母本阿魏酸酯酶A的最适反应温度相比，阿魏酸酯酶A突变体M12最适反应温度提高了11℃。在60℃条件下阿魏酸酯酶A突变体M12水解气爆玉米秸秆释放阿魏酸的效率与母本阿魏酸酯酶A相比有明显的提高。 本研究通过计算机辅助设计和定向进化手段改造源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A成功地提高了其热稳定性，该工作将推动阿魏酸酯酶A的研究和应用。具有较好稳定性和灵敏度的阿魏酸酯酶高通量检测体系的构建将推动新的阿魏酸酯酶的发现和其他阿魏酸酯酶的分子改造。
NETL