摘要
中性植酸酶是一种环境友好型饲料添加剂，它能显著提高动物对饲料中磷的利用率从而减少饲料中添加的无机磷，降低饲料成本，减轻环境的磷污染;还能降低植酸磷的抗营养作用，将被植酸螯合的Zn2+、Ca2+和Cu2+等多种离子及蛋白质释放出来供动物利用，对提高动物生产性能有重要意义。目前，对中性植酸酶的分子生物学、编码基因的分离克隆及表达、中性植酸酶在生产上的应用等方面还缺乏较深入的研究。因此，深入了解中性植酸酶独特的结构机理并通过酶分子改造提高其活性及通过添加稳定剂提高植酸酶热稳定性对以后中性植酸酶产业化生产具有重要的意义。 本文以前期得到的新型淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM1061中性植酸酶基因（GenBank登录号为HM747163）为基础，构建了高效表达新型中性植酸酶的重组大肠杆菌，对重组酶进行了亲合纯化并对酶学性质进行了研究。对新型中性植酸酶进行同源建模及评价。基于酶的结构分析，进行定点突变获得了四种突变酶，其中突变酶D148E活性比初始酶提高37.5％。对不同添加剂对突变酶D148E热稳定性的影响进行了研究，确定了最适的添加剂种类及浓度。 (1)野生中性植酸酶在大肠杆菌中的高效表达、纯化及酶学性质研究运用基因工程技术，将克隆到的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensDSM1061中性植酸酶基因构建到表达载体pET22b(+)上，并在E.coli BL21(DE3)中进行了高效表达。电泳结果表明该酶分子量约为42 kDa，目的蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白30％左右。利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化，酶学性质研究表明，其最适温度为65℃，最适pH为7.0，最大比活为15.5 U/mg。65℃时以植酸钠为底物的Km值为0.30 mmol/L。 (2)新型中性植酸酶结构模型构建及分子改造研究对获得的中性植酸酶进行序列及结构分析，研究表明所获得的中性植酸酶氨基酸序列与来自Bacillus.subtilis的植酸酶序列(Swiss-prot ID: O31097)最相似，序列一致性为98.7％，其在氨基酸位点为128、144、153、257和370处分别变异为Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。研究表明，获得的植酸酶的N端1-26个残基可能是信号肽序列。对获得的中性植酸酶进行了同源建模及评价，结果显示结构模型中的键长、键角及二面角的分布及结构合理。根据结构选择了四个突变残基，进行定点突变，得到了D52E、D148E、N156E、G212A四种突变酶，并对其酶学性质进行了测定。最适条件下野生酶、D52E、D148E、N156E、G212A的最大比活分别为15.5、9.7、21.3、7.4、1.4 U/mg。与野生酶相比突变酶D52E、N156E、G212A比活分别下降了37.4％、52.3％、91.0％，D148E比活提高了37.5％。 (3)通过添加稳定剂提高植酸酶热稳定性的研究研究了不同温度和不同浓度条件下糖类（海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉）、金属盐（氯化钙、氯化镁）对突变酶D148E热稳定性的影响。研究结果表明，添加稳定剂会促使植酸酶的热稳定性大幅度提高。稳定剂的性能由大到小依次为:氯化钙＞海藻糖＞淀粉＞蔗糖＞葡萄糖＞麦芽糖＞氯化镁。75℃受热时CaCl2的最适合浓度为0.02 mol/L，此时植酸酶剩余酶活112.1％，80℃、85℃、90℃下，CaCl2浓度为0.10 mol/L时剩余酶活最高，分别为112.0％、89.0％、67.7％。在所有受热温度下，添加CaC12的植酸酶比未添加CaCl2的植酸酶剩余活性大幅度提高，分别提高了33.7％、79.7％、73.9％和64.5％。
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