摘要
目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)上的大电导钙激活钾通道(large conductance calcium-activated potassium channels，BKCa)的活动直接参与了血管平滑肌的舒张调节，在血压维持中起重要作用。在天然细胞上有关BKCa通道的动力学特性、通道调控点、药物作用靶点等的研究存在一定的局限性，但是将BKCa通道蛋白重建到平面双分子层脂质膜(Panar lipid bilayers，PLBMs)上则可更好地进行以上研究。本实验旨在摸索建立稳定的平面双分子层脂质膜制备方法，并摸索将克隆的血管平滑肌细胞BKCa通道蛋白融合其上进行单通道电流研究。本项目通过联合单通道膜片钳技术，考马斯亮蓝染色和免疫印迹法(Western blot)等方法证实所建立的人工BKCa通道重建技术的可行性，为下一步研究BKCa通道调控点和药物作用靶点提供技术支持。 方法: (1)PLBMs实验:将不同浓度的卵磷脂或不同比例的卵磷脂与胆固醇混合液作为成膜液，采用涂抹法制备PLBMs;实验中控制膜脂质的成分和周围电解质环境，寻找最佳成膜条件;将含有两性霉素B的脂质体或α-toxin加入膜的一侧溶液内，使其与PLBMs融合并形成孔道，观察孔道形成过程中脂质膜的稳定性; (2)重建到PLBMs上的BKCa的单通道实验:将BKCa通道蛋白重建到PLBMs上进行单通道电流记录，通道信号经BC-535放大器放大，1KHz滤波，Clampex 10.2软件采集，并经Clampfit 10.1软件分析。 (3)转染有BKCaα亚基的人胚肾（human embryonic kidney，HEK293）细胞上的BKCa单通道膜片钳实验:该实验作为重建到脂质膜上的BKCa的对照实验。选取立体感强、状态好并转染有BKCaα亚基的HEK293细胞进行实验，在对称性高钾溶液中，采用内面向外模式(inside-out patch)记录BKCa的单通道电流。单通道电流信号经CEZ-2200膜片钳放大器放大，1KHz滤波后输入计算机，经pClamp 10.0软件采集记录，并用Clampfit 10.1软件进行数据分析。 (4)考马斯亮蓝染色和Western blot检测制备的BKCa脂质体的纯度:收集低渗裂解的转染有BKCaα亚基的HEK293细胞碎片，经20％-38％蔗糖/MOPS密度梯度离心得BKCa脂蛋白体，将BKCa脂蛋白体变性处理后加样，选择合适的电压进行SDS-PAGE电泳和转印。用BKCaα兔抗人多克隆抗体(1:500)孵育，洗膜后加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶10，000)孵育。GEL-Doc凝胶成像系统采集图像，Quantity One软件分析结果。 结果: (1)涂抹法制备PLBMs实验:采用不同浓度卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)制备的PLBMs可稳定3.5h，而用不同比例的卵磷脂(PC)和胆固醇（Cholesteryl，CH）制备的PLBMs可稳定2.5h。两性霉素B及α-toxin形成孔道过程中，脂质膜很稳定。 (2)重建到平面双分子层脂质膜上的BKCa的单通道基本特性: ①重建的BKCa通道电导值大，为206.8±16.86pS(n=4)。 ②通道具有明显的电压依赖性，在-60mV～+60mV的测试电压下， 随着细胞膜电位去极化程度的增加，BKCa通道的电流幅度(Amplitude，Amp)及通道的开放概率(Open probability，NPo)显著增加，通道的平均开放时间(Open time，To)延长，平均关闭时间(Close time，Tc)缩短。 ③通道具有明显的Ca2+敏感性，cis/trans侧浴液中Ca2+浓度分别由0M增加到1μM和100μM时，BKCa通道的开放概率(NPo)明显增加，呈Ca2+激活特性。 ④BKCa通道具有K+选择性，Cis/Trans侧K+浓度为140/140mM时重建的BKCa通道反转电位在0mV左右(n=4)，K+浓度为40/140mM时重建的BKCa通道反转电位在-30mV左右(n=2)，而根据Nernst方程计算，K+浓度为140/140mM时，K+平衡电位(K+ equilibrium potential，Ek)为0mV，K+浓度为40/140mM时Ek为-32.6mV。 (3)在inside-out模式下，HEK293细胞上BKCa的单通道的基本特性: ①HEK293细胞上的BKCa通道电导值大，为212.7±7.71pS(n=8)。 ②通道具有明显的电压依赖性，在0mV～+60mV的测试电压下，随着细胞膜电位去极化程度的增加，BKCa通道的电流幅度(Amp)及通道的开放概率(NPo)显著增加，通道的平均开放时间(To)延长，平均关闭时间(Tc)缩短。 ③通道具有明显的Ca2+敏感性，BKCa通道的开放概率(NPo)随浴液中[Ca2+]free浓度增加明显增加，呈Ca2+激活特性。 (4)考马斯亮蓝染色和Western blot检测结果:制备的脂蛋白体(proliposome)含BKCaα亚基，分子量大小为100kDa，制备的脂蛋白体同时含有其他蛋白质。 结论: (1)涂抹法可用于平面双分子层脂质膜的制备。 (2)平面双分子层脂质膜技术可用于BKCa通道的药理学和动力学特性的研究。 (3)重建后的BKCa具有电导值大，电压依赖性，Ca2+敏感性和K+选择性。 (4)目前制备的BKCa脂蛋白体含有其他蛋白。
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