摘要
研究背景： 目前骨科临床上常用的内固定材料主要为传统金属，这些材料最大的弊端是需二次手术取出。此外，传统金属与骨组织的力学性能不匹配，易产生“应力遮挡效应”，导致骨不连或再次骨折等并发症。生物可降解高分子材料作为上述金属材料的替代物，虽然可避免二次手术，但同时也存在一些问题，如体内降解速度过快或过慢、机械强度不足、生物相容性不佳、易导致组织炎症等。 镁合金是一种新型的生物可降解金属材料，具有较高的比强度和比刚度，适宜的密度及力学性能，能有效缓解应力遮挡效应等优点，近年来引起人们广泛的关注。但镁的耐蚀性差，植入体内降解速度过快，难以达到固定效果，并在腐蚀过程中产生大量的氢气，导致临床应用受到限制。表面改性可显著提高镁合金的耐蚀性能，是目前医用镁合金应用研究的重点。微弧氧化(micro-arcoxidation，MAO)是一种新兴的表面改性技术，与其它技术相比，它具有成本低、工艺简单、涂层与基体结合牢固、结构致密，良好的耐磨性及耐蚀性等优点，目前已在镁合金表面改性中得到广泛应用。 中科院金属研究所制备了表面MAO涂层镁合金ZK60，并已通过体外实验证明了其良好的耐蚀性能。但作为一种新型的医用可降解金属材料，其具体的生物学性能如何尚不清楚。 研究目的： 体外条件下观察表面MAO涂层镁合金ZK60对细胞增殖、黏附、成骨矿化及溶血的影响，初步评价材料的生物相容性及生物活性，验证其作为一种新型医用可降解金属材料的安全性及有效性，为后期动物实验及临床应用提供参考依据。 研究方法： 1.材料的表性及生物相容性 通过扫描电镜观察MAO涂层的表面形貌，并用能谱分析仪及X线衍射仪检测涂层的元素组成及化学成分。采用间接接触法和直接接触法进行细胞实验，实验分为裸镁合金组、涂层组、钛合金组及空白对照组，按照ISO10993-12标准(试样表面积/浸体介质=1.25cm2/ml)分别制备材料浸提液并培养细胞，空白对照组采用含10％FBS的H-DMEM培养基进行培养。倒置相差显微镜观察浸提液中细胞形态，通过检测细胞外乳酸脱氢酶(LDH)活性来评价材料的细胞毒性，并用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力，扫描电镜下观察材料表面细胞黏附形态，检测材料表面的蛋白吸附能力，进一步采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6'-diamidino-2-phenylindole，DAPI）和钙黄绿素/乙锭均二聚物-1(calcein-AM/ethidium homodimer-1，calcein-AM/EthD-1)染色法观察细胞的早期黏附和生长状态。 2.成骨矿化实验 通过间接接触法观察材料对细胞成骨矿化功能的影响。实验分为裸镁合金组、涂层组、钛合金组和空白对照组。采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性，茜素红染色法观察矿化结节形成并进行定量分析，进一步采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，QRT-PCR)技术检测细胞内成骨相关基因的表达。 3.溶血实验 实验分为裸镁合金组、涂层组、阴性对照组和阳性对照组，参照国家医用有机硅材料生物学评价实验方法GB/T16175-2008进行实验。肉眼观察材料的溶血作用，计算溶血率。 研究结果： 1.材料的表性及生物相容性 1.1扫描电镜下可见MAO涂层表面呈粗糙、多孔隙形态，孔隙直径约为1μm，周围均匀分布有微裂隙;材料横断面观察可见镁合金基体表面形成一约20μm的保护性涂层，涂层结构致密，与基体结合牢固;能谱分析结果显示涂层的主要组成元素为Mg、O和Si，同时含少量的Zn、F和K;X线衍射仪检测提示涂层的主要成分为硅酸镁(Mg2SiO4)和氧化镁(MgO)。 1.2显微镜下见各材料浸提液中细胞生长状态良好，细胞贴壁生长，轮廓清晰，形态多呈长梭形，大多细胞间以伪足形成连接，细胞内可见颗粒，未见明显细胞裂解或死亡，细胞形态毒性反应分级为0级。 1.3各组的LDH活性分别为裸镁合金组(1101.5±165.2)U/L、涂层组(1195±123.5)U/L、钛合金组(1126.5±158.5)U/L、空白对照组(1158.5±90.3)U/L，组间差异无统计学意义(P＞0.05)。 1.4细胞增殖活力检测提示，随着培养时间的延长，各组OD值逐渐升高，不同时间点组内差异有统计学意义(P＜0.05);在浸提液培养细胞的第1天，裸镁合金组及涂层组的OD值低于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，相对增殖率分别为90％和87％，细胞毒性评价为1级;而在第3天和第5天，各组间OD值无统计学差异(P＞0.05)，实验材料组的细胞相对增殖率均为100％左右，毒性评价为0级。 1.5扫描电镜下可见涂层组和钛合金组材料表面细胞密集，而裸镁合金表面细胞数量较少;涂层组细胞为长梭形或多角形，形态饱满，细胞伸展性良好并通过伪足形成连接，与钛合金组相比，细胞形态更佳、粘附更紧密，而裸镁合金组材料表面细胞呈梭形，形态欠饱满，伸展性较差。 1.6涂层组材料表面的蛋白吸附量为152.7±6.3（μg/ml），明显高于裸镁合金组和钛合金组的96.3±3.9(μg/ml)和96.1±8.7(μg/ml)，差异有统计学意义(P＜0.05)，而裸镁合金组与钛合金组间比较，无统计学差异(P＞0.05)。 1.7 DAPI染色示随着培养时间延长，各组材料表面细胞黏附数量逐渐升高，不同时间点组内差异有统计学意义(P＜0.05);在各个时间点，涂层组镁合金材料表面的细胞黏附数明显高于裸镁合金组和钛合金组，差异有统计学意义(P＜0.01);在60min，裸镁合金组和钛合金组之间的细胞黏附数量无明显差异(P＞0.05)，而在30min和120min，裸镁合金组的细胞黏附数低于钛合金组，差异有统计学意义(P＜0.01)。 1.8材料表面活/死细胞染色见裸镁合金组材料表面细胞数量少，大多呈圆形，细胞形态较差;而涂层组和钛合金组大多为绿染细胞，形态良好，伸出伪足粘附于材料表面，且在涂层组表面细胞显得更饱满，伸展性更佳。 2.成骨矿化实验 2.1各组间细胞内总蛋白含量无明显差异(P＞0.05)，而涂层组与裸镁合金组中的ALP表达活性明显高于钛合金组和空白对照组(P＜0.01)，且涂层组的ALP活性较裸镁合金组更高(P＜0.01)。 2.2矿化结节茜素红染色见各组板孔内呈不同程度的深红色，其中涂层组染色最深，面积最广，其次为裸镁合金组，钛合金组与空白对照组相比外观无明显差异;进一步定量分析显示裸镁合金组和涂层组OD值分别为0.218±0.008和0.299±0.036，明显高于钛合金组及空白对照组的0.109±0.001和0.112±0.006，差异有统计学意义(P＜0.01);其中，涂层组高于裸镁合金组，差异有统计学意义(P＜0.01)，钛合金组与空白对照组间无统计学差异(P＞0.05)。细胞的成骨矿化程度依次为:涂层组＞裸镁合金组＞钛合金组/空白对照组。 2.3成骨相关基因的表达量检测结果提示钛合金组和空白对照组ALP、OPN、OCN和CO I四种基因的表达量均无统计学差异(P＞0.05);裸镁合金组和涂层组的ALP基因相对表达量分别为2.155±0.339和3.990±0.181，明显高于钛合金组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，且涂层组高于裸镁合金组(P＜0.05)，结果与上文ALP活性检测一致;裸镁合金组和涂层组的OPN基因相对表达量分别为1.799±0.066和1.838±0.038，明显高于钛合金组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，而裸镁合金组与涂层组相比无明显统计学差异(P＞0.05);OCN和COⅠ基因相对表达量裸镁合金组和涂层组均明显高于钛合金组和空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，且涂层组表达量较裸镁合金组更高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.溶血实验 肉眼下可见涂层组离心管中上清液呈无色透明，与阴性对照组管中的上清液颜色几乎一样，未见明显溶血现象;裸镁合金组的上清液呈淡红色，有较明显的溶血现象;阳性对照组管中上清液呈玫瑰红色，红细胞完全破裂溶解。实验材料中裸镁合金组的溶血率为28.7％，明显高于国家规定的标准(5％)，涂层组的溶血率仅为1.04％，且其OD值与阴性对照组比较无统计学差异(P＞0.05)，符合溶血标准，不会引起明显溶血反应。 结论： 1.MAO涂层技术可在镁合金表面形成粗糙、多孔隙的表面形态; 2.镁合金ZK60及其MAO涂层材料均可通过细胞毒性评价，且镁合金表面经MAO涂层处理后，对细胞的亲和力明显改善，促进细胞粘附生长，表现出良好的生物相容性; 3.镁合金ZK60及其MAO涂层材料能促进细胞成骨分化、矿化及成骨相关基因表达，显示出良好的骨诱导活性，且涂层材料的活性更高，这可能与涂层中硅酸盐的释放有关; 4.裸镁合金ZK60具有一定的溶血作用，但表面经MAO涂层处理后溶血率可符合生物材料的要求，有良好的血液相容性; 5.MAO涂层技术能明显改善镁合金的生物相容性及生物活性，是一种较理想的镁合金表面改性方法; 6.本课题未对实验材料的体内降解特性及生物相容性进行研究，因此表面MAO涂层镁合金ZK60能否成为一种新型骨科内植材料有待后期进一步研究。
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