摘要
目的：观察木犀草素(luteolin，Lut)是否通过ERK1/2及JNK通路对缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)成年大鼠离体心脏及单个心肌细胞的收缩功能具有改善作用，并探讨具体的机制。通过检测血流动力学、心肌梗死面积、LDH释放量、单个心肌细胞的收缩功能、TUNEL、以及凋亡和收缩相关蛋白表达等指标，验证木犀草素的心肌保护作用及机制，为临床治疗缺血性心脏疾病提供理论基础和实验依据。 方法：1.清洁级成年雄性Wistar大鼠，首先在I/R之前应用ERK1/2抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125预处理，分别检测p-ERK1/2和p-JNK的表达，通过与单纯I/R组比较，观察I/R过程中ERK1/2和JNK通道的活化作用。随后器官水平分为以下几组:DMSO组(DMSO，n=6)，I/R组(I/R，n=6)，Lut预处理组（Lut+I/R，n=6），PD98059预处理组(PD+I/R，n=6)，PD98059+Lut预处理组（PD+Lut+I/R，n=6），SP600125预处理组（SP+I/R，n=6）。大鼠麻醉后，立即取心脏挂于Langendorff装置上，待心脏稳定后，DMSO组离体心脏持续灌流200min;I/R组离体心脏持续灌流50min后，再缺血30min复灌120min; Lut+I/R组离体心脏持续灌流20min，进行Lut预处理30min后再缺血30min复灌120min;PD+I/R组离体心脏持续灌流20min，进行PD98059预处理30min后再缺血30min复灌120min; PD+Lut+I/R组进行Lut预处理前用PD98059预处理20min，余处理同Lut+I/R组;SP+I/R组离体心脏持续灌流20min，进行SP600125干预30min后再进行缺血30min复灌120min。同时检测大鼠离体心脏血流动力学指标。各组复灌10min时，留取冠脉流出液测LDH含量，冷冻心脏，测量各组心脏的心肌梗死面积。 2.酶解法分离正常雄性Wistar大鼠心脏，得单个心室肌细胞并进行培养。首先用2，4，8，16μmol/L四个浓度的Lut进行预处理后，测定这些细胞在异丙肾上腺素刺激(isoproterenol，ISO)状态下收缩幅度，台盼蓝染色检测杆状率，留取细胞上清测LDH含量，通过以上三个方面确定Lut的最佳浓度。然后进行如下的实验:DMSO组心肌细胞正常孵育19h; I/R组心肌细胞正常孵育14h后，行缺氧3h复氧2h模拟I/R; Lut+I/R组心肌细胞正常孵育2h后加入最佳浓度木犀草素进行预处理12h，再行缺氧3h复氧2h模拟I/R损伤。PD+Lut+I/R组，心肌细胞正常孵育1h后，在木犀草素预处理前用PD98059干预1h，余处理同Lut+I/R组。SP+I/R组心肌细胞正常孵育13h后加入SP600125进行预处理1h，再行缺氧3h复氧2h模拟I/R损伤。收集各组心肌细胞，测单个细胞的收缩幅度，留取上清测LDH含量，Western blot检测Bcl-2、Bax、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、PP1a、p-PP1a、PLB、p-PLB及SERCA2a蛋白表达变化。 结果：1.预实验显示，I/R过程主要激活了JNK通路而非ERK1/2通路;Lut浓度在8umol/L时可明显改善I/R所引起的LDH释放量增加、心肌细胞收缩功能和下调细胞死亡率的增加。 2.在离体器官水平上，与正常组相比较，I/R组能够明显地降低离心脏功能的各种参数，促进冠脉流出液中LDH的释放量，增加心肌梗死面积。Lut及JNK抑制剂SP600125预处理可保护缺血/再灌注后的心肌，改善离体心脏的心功能，抑制冠脉流出液中LDH的量，减少心肌梗死面积。在Lut之前用ERK1/2通路抑制剂PD98059干预，其保护作用可部分被阻断，而单独用PD98059预处理相对于I/R组上述指标未见明显的变化。 3.在细胞水平上，与溶剂对照组相比较，模拟I/R显著降低了单个心肌细胞的收缩幅度，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2、增加了促凋亡Bax的表达，使得Bcl-2/Bax的比值降低;同时降低了收缩正相关蛋白p-ERK1/2、SERCA2a及p-PLB蛋白的表达，增加了收缩负相关蛋白p-JNK、p-PP1a的表达。用Lut及JNK抑制剂SP600125预处理后能够不同程度的改善细胞收缩幅度，增加了Bcl-2/Bax的比值。其中Lut可影响收缩相关蛋白PP1a、PLB及SERC2A的表达，JNK抑制剂预处理前后未见对上述收缩蛋白的表达有影响。而在Lut之前用ERK1/2抑制剂PD98059干预后其保护作用可部分被阻断。 结论：1.I/R过程主要激活了JNK通路而非ERK通路。 2.Lut及JNK抑制剂SP600125可改善I/R大鼠离体心脏心功能参数，抑制心肌细胞的凋亡，改善单个心肌细胞的收缩功能。 3.JNK对于收缩相关蛋白PP1a、PLB及SERCA2a的表达无影响。 4.Lut通过ERK1/2通道来调节凋亡蛋白Bcl-2、Bax和收缩相关蛋白p-ERK1/2、SERCA2a、p-PLB及p-PP1a的表达，而发挥心脏保护功能。
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