摘要
背景及目的: 肺癌是世界范围内最常见的肿瘤。据统计,仅2008年就有161万新增病例,其中约80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。虽然手术仍然是NSCLC的首选治疗方法,但其确诊时大多数已处于中晚期,只有少部分患者可以得到手术根治,约70%的NSCLC患者在整个治疗过程中需要接受放疗。然而,临床上不少患者接受放疗后出现复发,最终导致患者死亡。究其原因,肺癌细胞对放射线抗拒起重要作用。因此,深入研究放射耐受产生的机制,探寻潜在的干预靶点,对于提高放疗的治疗效果,改善肺癌预后具有重要意义。 现已明确,放化疗耐受是肿瘤干细胞的特征之一。而其中具有广泛基因调控作用的微小RNA(microRNA,miR)的变化及其意义,更是目前研究的热点。本课题组前期研究发现,A549肺腺癌干细胞样细胞与普通A549细胞相比,miR-18a水平降低。由此可以推测,miR-18a下调可能和肺腺癌细胞照射耐受有关,但其具体作用机制并不明了。晚近研究表明,共济失调-毛细血管扩张症突变基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)在DNA损伤修复中起重要作用;而其3’非编码区具有miR-18a结合位点。由此,我们可以进一步推测:miR-18a通过ATM调控DNA损伤修复,在肺腺癌A549细胞照射耐受中起重要作用。为验证这一设想,本实验拟先观察A549细胞受X线照射后miR-18a的变化;然后通过转染miR-18a模拟物,检测其对A549细胞照射敏感性的影响;最后,检测过表达miR-18a的A549细胞中ATM蛋白的改变,以初步阐明miR-18a在肺腺癌细胞照射耐受中调控作用的分子机制。 材料和方法: 1.X线照射对A549细胞miR-18a表达的影响:利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测A549细胞受2GyX线照射后miR-18a的变化。 2.miR-18a对A549细胞照射敏感性的影响:以人工合成的miR-18a模拟物(mimics)转染肺腺癌A549细胞,获得miR-18a高表达A549细胞。通过集落形成实验,分别检测miR-18a高表达A549细胞受0,2,4,6,8GyX线照射后的克隆形成能力,描记细胞存活曲线并计算放疗敏感性指标(D0、Dq、SF2),判断miR-18a对A549细胞照射敏感性的影响。 3.miR-18a影响A549细胞照射敏感性的机制:以Western Blot检测过表达miR-18a的A549细胞中ATM蛋白的改变,初步阐明miR-18a在肺腺癌细胞照射耐受中调控作用的分子机制。 结果: 1.A549细胞受2GyX线照射后,从0.5小时开始,miR-18a水平降低,直至照射后4小时miR-18a仍处于低水平。以0h组作为基线水平,0.5h、1h、2h和4h组miR-18a相对量分别为0.20±0.05,0.22±0.10,0.18±0.04和0.31±0.09。与0h组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。 2.miR-18a模拟物(mimics)成功转染肺腺癌A549细胞,转染后miR-18a水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。集落形成实验显示,miR-18a可以降低A549细胞2Gy时存活分数(SF2),差异有统计学意义(P<0.05)。拟合剂量-存活曲线显示:miR-18a可以降低A549细胞的D0、Dq、SF2值。 3.半定量分析显示,以空白对照组作为基线,过表达miR-18a组共济失调-毛细血管扩张症突变基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)蛋白及其活化形式磷酸化的ATM(phospho Ser1981)水平分别降至0.68±0.12和0.48±0.05(P<0.05)。 结论: 1.miR-18a水平降低,可能是A549细胞受X线照射后发生耐受的一个重要原因。 2.miR-18a主要通过下调在DNA损伤修复中起重要作用的ATM及其磷酸化活性形式ATM(phospho Ser1981)的表达,增加A549细胞的照射敏感性。
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