摘要
水稻是研究单子叶植物基因组功能的模式植物，也是世界上最重要的粮食作物之一。低温、干旱和高盐等非生物胁迫严重威胁水稻的生长，是造成水稻减产的主要因素，甚至危及粮食安全。因此，研究水稻抵抗逆境胁迫的分子和生理机制，挖掘优良的抗逆基因，提高水稻对低温、高盐和干旱等逆境的耐受能力有重要的理论和现实意义。 NAC是植物特有的一类转录因子，不仅在植物的生长发育、器官建成和激素调节方面发挥重要作用，而且也在生物和非生物胁迫应答过程中扮演重要角色。本研究从水稻盐处理的芯片上挑取了一个上调倍数较高的基因—OsNAC5，表达谱分析显示其表达受低温、干旱和高盐诱导，也受植物激素如ABA、乙烯、MeJA和BR等诱导，组织表达模式分析结果显示该基因主要在叶片中表达。 为了研究OsNAC5的功能，本研究构建了OsNAC5超表达和RNAi沉默载体，利用农杆菌介导的水稻遗传转化，获得了超表达和RNAi转基因株系。种子萌发实验结果表明，超表达OsNAC5增强了转基因水稻萌发时期对盐和旱的抗性，并提高了对ABA的敏感性，暗示OsNAC5可能参与ABA信号转导途径。低温、高盐和干旱胁迫处理后发现超表达株系存活率显著高于野生型，沉默株系则显著低于野生型，表明超表达OsNAC5增强了水稻苗期的抗逆性。 为了进一步探求OsNAC5增强超表达株系抗性的生理和分子机制，我们测定了相关生理指标（脯氨酸、可溶性糖、MDA和H2O2），并检测了脯氨酸和糖的相关合成转运基因的表达。结果显示逆境胁迫下OsNAC5超表达株系体内脯氨酸和糖的相关基因的表达量以及脯氨酸和可溶性糖的含量均显著高于野生型和沉默株系，而MDA和H2O2的含量则显著低于野生型和沉默株系，表明在逆境胁迫下超表达株系通过积累更多的脯氨酸和可溶性糖，降低了氧化胁迫的程度从而降低了细胞受到的伤害，最终提高了对逆境的抗性。 F-box蛋白参与各种生物学过程，如生物节律、自交不亲和、光形态发生、逆境响应以及激素转导等。水稻中存在大量的F-box蛋白，但是功能被报道的仅有几例，尤其是在逆境胁迫以及葡萄糖信号转导过程的功能研究几乎为空白。为了研究水稻F-box蛋白在逆境胁迫中的功能，本论文从水稻的高盐处理芯片中挑选了一个表达量上调的基因，利用蛋白质结构域预测网站发现其N端有一个保守的DNA结合域即F-box结构域，属于F-box家族，命名为OsFBX352。亚细胞定位实验结果表明，OsFBX352定位在细胞核中和细胞膜上，酵母自激活实验表明OsFBX352没有自激活活性。组织表达模式分析发现，OsFBX352在根、茎、叶和花中均有表达，但是在叶中表达最高。OsFBX352的表达受低温、干旱和高盐诱导，同时也受生长素、ABA、MeJA和BR诱导。 为了研究OsFBX352的生物学功能，构建OsFBX352的超表达和RNAi沉默载体，获得了超表达和RNAi转基因水稻植株。研究发现，正常条件下转基因植株表型和野生型没有明显差异，但是在低温、高盐和干旱处理下OsFBX352超表达水稻幼苗存活率低于野生型，表明其可能负调控水稻对逆境的响应。 研究发现OsFBX352在种子萌发早期被大量诱导表达，但是其表达量却严重被葡萄糖抑制。进一步研究发现，葡萄糖处理时的种子萌发和萌发后生长阶段，葡萄糖的抑制效应与OsFBX352的表达量呈负相关趋势，即相比于野生型，OsFBX352超表达株系对葡萄糖的敏感性显著降低;而RNAi株系对葡萄糖的敏感性显著增加。我们进一步探求了转基因株系对葡萄糖敏感性改变的生理机制，发现在葡萄糖处理时，相比于野生型，超表达株系种子内积累较少的ABA，因此萌发速度显著提高;而RNAi株系种子内积累更多的ABA，由此导致萌发速度显著降低。进一步探究其分子机制，发现葡萄糖处理时，超表达株系种子内ABA合成基因OsNCED2和OsNCED3的表达量显著低于野生型;而RNAi株系种子内ABA合成基因表达量显著高于野生型。与OsNCEDs的表达模式相反，超表达株系种子内OsABAox2和OsABAox3表达量的增加幅度显著高于野生型;而Ri株系种子内OsABAox2和OsABAox3的增加幅度显著低于野生型。这些结果表明OsFBX352可能是通过抑制ABA合成和增强ABA代谢通路，最终降低ABA含量，最终影响种子萌发过程中对葡萄糖的敏感性。 综上所述，本论文从水稻中分离到一个NAC家族的转录因子—OsNAC5，超表达OsNAC5能够提高水稻对逆境胁迫的抵抗能力，且不会造成水稻植株矮化和产量的降低。这表明OsNAC5是一个优良的抗逆基因，在抗逆遗传改良中可能会有很好的应用前景。另外，本研究还分离克隆了一个编码F-box蛋白的基因，OsFBX352，并利用超表达和沉默转基因水稻株系对其功能进行了阐释。结果表明，OsFBX352通过影响ABA合成参与调控葡萄糖对水稻种子萌发的过程。这一发现拓展了对F-box蛋白功能的理解。
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