摘要
谷胱甘肽转移酶(GST)是一类由大型基因家族编码的多功能蛋白，在植物解毒异源物质以及氧化应激代谢中发挥重要作用。至今，大量的GST基因家族研究主要集中于维管植物中，尤其以农作物为主，而几乎没有研究关注非维管植物的GST基因家族。此外，陆地植物GST基因家族的进化模式仍然没有被揭示。在本论文中，我们以典型的非维管植物——小立碗藓（Physcomitrella patens）为研究材料，小立碗藓在从藻类向种子植物进化过程中处于独特演化位置，而且是唯一被全基因组测序的苔藓植物。本论文对小立碗藓GST基因家族进行了分子进化、基因表达、蛋白功能分析，并综合江南卷柏、火炬松、水稻、拟南芥和杨树GST家族的基因序列，探讨了陆地植物进化过程中GST基因家族的进化模式。本论文的主要结果如下: 1、从小立碗藓基因组中鉴定出37个GST基因，这37个GST基因分为十个类型，其中包括phi、DHAR、theta、zeta、lambda、EF1Bγ、Ure2p、TCHQD和两个新的类型。通过系统发生以及基因结构分析，将这两类新的GST命名为hemerythrin和iota亚家族。此外，由于在小立碗藓基因组中没有发现维管植物中数目最多的Tau类GST，我们推测Tau类GST可能起源于维管植物。 2、生物信息学分析表明，iota类GSTs仅在小立碗藓和江南卷柏中被发现。根据序列比对与蛋白质结构分析，iota类GSTs可能具有氧化还原酶活性而不是GSH结合活性。而hemerythrin蛋白结构域在后生动物、原核生物、原生生物、真菌和植物中均存在，在小立碗藓物中该结构域与GST蛋白结构域进行了融合，推测hemerythrin类GSTs的功能是通过催化GSH和金属离子的结合，达到重金属解毒的作用。Ure2p类GSTs是细菌和真菌中常见的一类GST基因，但在小立碗藓和江南卷柏基因组分别含有1个和2个Ure2p类GSTs，在其他种子植物中没有发现。综合序列相似性、系统发生分析、蛋白结构模拟、以及小立碗藓PpUre2pl酶学活性等数据，推测小立碗藓Ure2p基因可能是通过水平转移从细菌中转移过来的。 3、在10个小立碗藓GST亚家族中，phi类GSTs数量最多，有10个成员。其中有5个成员（PpGSTF1、3、4、9和10）在所有生长条件下均检测表达，而有4个基因（PpGSTF2、5、6和7）在胁迫下表达，1个基因（PpGSTF8）在所有检测样品中未发现表达。我们在大肠杆菌中表达了8个phi类GST蛋白（PpGSTF1、2、3、4、5、7、9和10），其中3个（PpGSTF2、4和5）形成包涵体，而其余5个以可溶性蛋白形式表达。我们纯化了这5个phi类GST蛋白，并分析了他们的生化功能，发现这几个蛋白的底物谱存在明显差异。例如，PpGSTF9仪对Cum-OOH检测到活性，而PpGSTF3和PpGSTF10对CDNB、NBD-C1、DCNB、NBC和Cum-OOH5种底物均检测到活性。小立碗藓4个phi类GSTs（PpGSTF1、3、7和10）对底物GSH都具有较强的亲和力，但是其催化效率(kcat/Km)存在明显差异。因此，综合基因表达模式和蛋白质功能特性，小立碗藓phi类GSTs表现出高度的功能分化。 4、维管植物中均含有一个TCHQD基因，但小立碗藓有5个TCHQD拷贝，我们发现PpTCHQD2蛋白定位在细胞质和细胞核，PpTCHQD3仅定位在细胞质，而PpTCHQD5定位于叶绿体中，亚细胞定位的差异可能预示着功能的分化。小立碗藓DHARs具有巯基转移酶活性，但没有GSH结合活性。其他小立碗藓GST亚家族在基因结构和、或不同非生物胁迫下的基因表达或编码蛋白的亚细胞定位上也存在分化。 5、分别对小立碗藓、江南卷柏、火炬松、水稻、杨树和拟南芥的phi、zeta、theta、lambda、DHAR、TCHQD和EF1Bγ亚家族进行系统发生分析，发现不同亚家族的GST在陆地植物进化过程中具有不同的重复模式。 综合系统发生分析、基因表达模式、酶底物特异性、酶动力学、亚细胞定位等数据，本论文阐述了小立碗藓GST基因家族在不同层次上的功能分化模式，并综合其他植物GST基因家族序列数据，揭示了GST基因家族在陆地植物中复杂的进化模式。
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