摘要
胚胎干细胞是由内细胞团分离培养得到的,在适当的条件下能分化成所有类型的细胞。为筛选出能够维持绵羊类胚胎干细胞多能性的因子,以实验室建系的oESC-like为材料,培养细胞8d,从形态、增殖、AKP以及多能性候选基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28mRNA表达量的变化,分析绵羊类胚胎干细胞的多能性,确定维持绵羊类胚胎干细胞多能性的因子。主要研究结果: 在N2B27/CH中,添加PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PDhLIF/BMP4培养8d,通过与本实验室原培养体系N2B27/CH/bFGF相比,结果显示,添加PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4oESC-like细胞都表达AKP与Sox2、Oct4免疫荧光蛋白;添加PD、PD/hLIFoESC-like细胞之间的结合致密,oESC-like细胞的生长速度减慢;而添加PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4oESC-like细胞之间的结合疏松,oESC-like细胞的生长速度增快。添加PD和PD/hLIF使多能性候选基因Lin28与c-Myc表达量升高差异极显著(P<0.01),Nestin的表达量降低差异极显著(P<0.01),加入PD/hLIF使Oct4表达量升高差异极显著(P<0.01),添加PD/BPM4、PDhLIF/BMP4使多能性候选基因Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4的表达量降低差异极显著(P<0.01),Nestin与Lin28的表达量降低差异极显著(P<0.01)。 在培养体系N2B27/CH/bFGF中,分别加入PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PDhLIF/BMP4培养细胞8d,与N2B27/CH/bFGF相比,结果显示:AKP染色及Sox2与Oct4免疫荧光蛋白染色结果表明,添加不同因子后oESC-like显示胚胎干细胞多能性,添加PD多能性侯选基因Oct4与Klf4mRNA的表达量升高差异显著(P<0.01),Nestin与Lin28的表达量降低差异极显著(P<0.01),Sox2与c-Myc升高差异不显著。添加hLIF/PD使多能性候选基因Oct4的表达量表达量升高差异极显著(P<0.01),c-Myc、Klf4、Lin28表达量升高差异不显著,Nestin、Sox2表达量降低差异不显著。添加PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4使Oct4、Sox2、Nestin表达量降低差异显著(P<0.01),使Lin28、c-Myc、Klf4表达量降低差异不显著。 分别将选出的N2B27/CH/PD、N2B27/CH/PD/hLIF、N2B27/CH/bFGF/PD、N2B27/CH/bFGF/PD/hLIF进行培养,结果显示,添加PD、PD/hLIF与bFGF/PD、bFGF/PD/hLIF相比,oESC-like细胞表达碱性磷酸酶、生长速度快、细胞之间的结合更加致密,且多能性候选基因Sox2与Oct4表达免疫荧光蛋白。添加PD与bFGF/PD相比,oESC-like细胞多能性候选基因Oct4、Klf4与c-Myc的表达量升高差异极显著(P<0.01),Sox2的表达量升高差异不显著,c-Myc与Nestin的表达量降低差异极显著(P<0.01)。
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