摘要
新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neosporacaninum)引起的一种全球性的原虫病,该病对牛的危害最为严重,是世界范围内造成奶牛流产、产弱胎、死胎、木乃伊胎的主要原因之一。该病的危害程度存在着明显的地区差异,目前仍没防治新孢子虫病的有效药物和疫苗,“淘汰患畜”成为控制该病的唯一途径,因此,研发新型检测试剂盒及亚单位疫苗就显得尤为重要。 (I)含有原核重组表达质粒pGEX-4T-tNcSRS2的宿主菌BL21在IPTG诱导下,以包涵体的形式表达重组蛋白GST-tNcSRS2,该蛋白经过包涵体洗涤液洗涤、透析后,采用GST亲和层析法过柱纯化,用改良型BCA蛋白质定量检测试剂盒测得纯化后的蛋白浓度为232.9μg/mL,以此重组蛋白作为包被抗原,组装了新孢子虫rELISA抗体检测试剂盒,对组装的试剂盒进行了特异性检测试验、敏感性试验和重复性试验,发现与弓形虫、布氏杆菌不发生任何交叉反应,其阳性血清稀释至1:1600时,仍可检测为新孢子虫阳性,批内和批间重复性试验的变异系数均在10%以下。该试剂盒在-20℃至少可以保存6个月以上,与美国IDEXX商品试剂盒和比利时Bio-X商品试剂盒的符合率分别为90.45%和93.46%。应用该试剂盒检测了疑似区被检样品(n=1329),查出了新疆境内新孢子虫病感染情况,平均感染率为11.8%,检测结果均用商品化检测试剂盒验证。 (II)根据已发表的新孢子虫NcSRS2基因序列设计引物,通过PCR方法从牛新孢子虫地方阳性全血DNA中扩增得到目的基因,将其克隆至真核表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-tNcSRS2,PCR和双酶切鉴定后测序,结果与GenBank中已发表的犬新孢子虫Nc-1株的核苷酸序列同源性为99.90%。重组质粒pPIC9K-tNcSRS2经SalI线性化后,电转化整合到毕赤酵母GS115上,设置G418浓度梯度进行筛选,对筛选的高抗性阳性转化子进行PCR鉴定,得到重组酵母菌株。在甲醇的诱导条件下,表达大小约37kDa的重组蛋白。对得到的重组酵母转化子表达条件的优化结果为:诱导温度为29℃,磷酸钾缓冲液的pH值为7.0,甲醇终浓度为0.25%,诱导时间为72h。Westernblot结果表明,利用毕赤酵母表达的新孢子虫NcSRS2蛋白能与新孢子虫阳性血清发生反应,产生特异性条带,得到的目的蛋白具有反应原性,为新孢子虫病亚单位疫苗的研制奠定了基础。
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