摘要
研究背景和目的：研究表明花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)是机体内最为丰富的物质之一。经细胞色素P450(CYP450)表氧化酶途径代谢成四种具有重要生物活性的内源性物质,分别为:5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET以及14,15-EET。在机体内发挥着重要的作用,包括降压、抗炎、抗凋亡、抗心肌损伤和抗动脉粥样硬化作用,其效应可能与激活MAPK与PI3K/AKT信号通路有关。 2型糖尿病是一种复杂的、多基因疾病。胰岛素抵抗和β细胞功能障碍是其主要的病理生理问题,可并发心脑肾等多重慢性并发症,给个人和社会造成极大的经济负担。研究表明选择性抑制可溶性环氧化物水解酶(sEH)或敲除sEH基因能明显增强胰岛素信号,改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量。再者,选择性抑制可溶性环氧化物水解酶(sEH),增加内源性EETs水平能通过阻止NF-κβ的激活而增强阿司匹林的抗炎效应。然而,EETs改善胰岛素抵抗和外周组织胰岛素敏感性的机制尚不清楚。 本研究通过尾静脉注射rAAV-2J2病毒,在db/db2型糖尿病小鼠过表达CYP2J2基因和通过外源性14,15-EET干预FFA诱导的C2C12小鼠骨骼肌胰岛素抵抗模型来研究过表达CYP2J2改善骨骼肌胰岛素抵抗的机制。 方法：实验动物C57BL/6和db/db小鼠各60只,随机各分6组,每组10只。(1)C57BL/6组及db/db组注射生理盐水,(2)C57BL/6+rAAV-GFF组及db/db+rAAV-GFP组注射rAAV-GFP,(3)C57BL/6+rAAV-CYP2J2组及db/db+rAAV-CYP2J2组注射rAAV-CYP2J2,(4)C57BL/6+GW9662组及db/db+GW9662组GW9662灌胃,(5)C57BL/6+rAAV-GFP+GW9662组及db/db+rAAV-GFP+GW9662组注射rAAV-GFP并GW9662灌胃,(6)C57BL/6+rAAV-CYP2J2+GW9662组及db/db+rAAV-CYP2J2+GW9662组注射rAAV-CYP2J2并GW9662灌胃,实验开始前留取初始血标本,以后每两周称体重、取血一次,检测血清中血糖,血脂及胰岛素的浓度,实验结束后进行腹腔注射葡萄糖耐量试验以检测CYP2J2基因过表达对db/db小鼠胰岛素抵抗的影响,实验结束后处死动物,westernblot检测基因导入后骨骼肌CYP2J2、ERK、Iκβα、IR、PI3K、AKT、AS160、PMGLUT4及PPARγ蛋白的表达情况。同时通过FFA诱导小鼠骨骼肌细胞C2C12发生胰岛素抵抗建模、加或不加14,15-EET及GW9662,进一步研究CYP2J2改善骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制。 结果：CYP2J2基因导入后,C57BL/6小鼠各种生化指标,特别是糖脂代谢指标水平均无显著性差异(P>0.05)。与db/db组及db/db+rAAV-GFP组相比,过表达CYP2J2基因显著降低了db/db2型糖尿病小鼠的血糖、血甘油三脂、血胆固醇水平(P<0.05),改善葡萄糖耐量(P<0.05),但却升高血胰岛素水平(P<0.05),然而db/db+rAAV-CYP2J2+GW9662组则明显抑制了CYP2J2的降血糖、血甘油三酯、血胆固醇及改善葡萄糖耐量的效应(P<0.05)。westernblot检测表明:与db/db+rAAV+GFP组相比较,db/db+rAAV-CYP2J2组的P-IR、P(Ser473)-AKT、P(Thr642)-AS160、PI3K、PMGLUT4、PPARγ蛋白表达水平明显升高(P<0.05),P(Thr202/tyr204)-ERK蛋白表达水平明显被抑制(P<0.05),Iκβα蛋白降解减少(P<0.05),加入PPARγ抑制剂GW9662后上述保护效应被抑制(P<0.05),体外实验也证明了与FFA组及FFA+Insulin组相比,外源性14、15-EET能明显提高P-IR、P(Ser473)-AKT、P(Thr642)-AS160、PI3K、PMGLUT蛋白表达水平明显升高(P<0.05),抑制P(Thr202/tyr204)-ERK蛋白表达水平(P<0.05),减少Iκβα蛋白降解(P<0.05)。加入PPARγ抑制剂GW9662后上述保护效应被抑制(P<0.05)。 结论：CYP2J2过表达能明显改善db/db2型糖尿病小鼠骨骼肌胰岛素抵抗,其分子机制可能是通过上调PPARγ、抑制ERK的磷酸化水平,抑制Iκβα降解,进而激活IR/IRS-1/PI3K/AKT/AS160/GLUT4通路发挥改善2型糖尿病及骨骼肌胰岛素抵抗作用。
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